中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng) 在實(shí)驗(yàn)中，有時(shí)候需要轉(zhuǎn)化效率比較高的感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，如在建庫或者轉(zhuǎn)化比較珍貴的材料時(shí)，用普通方法制備的感受態(tài)就不能滿足實(shí)驗(yàn)需要。超級(jí)感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率比普通感受態(tài)高得多，轉(zhuǎn)化效率可以達(dá)到109或1010，因此可以用超級(jí)感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。下面是超級(jí)感受態(tài)的制備方法。
一、材料準(zhǔn)備
1) 250 ml TB溶液
10mM Pipes or 10 mM Hepes，0.65g
15 mM CaCl2，0.55g
250 mM KCl，4.66g
55 mM MnCl2，2.47g
除MnCl2外，將其它成份溶解于ddH2O后，用0.1M HCl調(diào)節(jié)pH值至6.7（如果HCl加過量了，必須廢棄溶液后重新配制，不能用堿再調(diào)低pH值后使用），然后將2.475g MnCl2加入溶液，溶解后定容，用0.45 um孔徑的濾膜過濾除菌，分裝為每瓶50 ml，4°C貯存?zhèn)溆谩?br />
2) 其它溶液
250 mM KCl溶液100 ml：將1.86 g KCl溶解到100 ml ddH2O。
1M MgCl2 +1 M MgSO4溶液10 ml：先配制1M MgCl2溶液，然后加入MgSO4，溶解后高壓滅菌。
50 ml of 1 M glucose with ddH2O, filter, aliquot in 1.5 ml, store at -20°C
100 ml SOB培養(yǎng)基：
蛋白胨（Bacto tryptone）：2 g
酵母提取物（Bacto yeast extract）：0.5 g
NaCl：0.05 g
上述成份溶解于ddH2O后，加入10 ml 250 mM的KCl溶液，用5N NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0 (~0.2 ml)，用ddH2O定容至100 ml，高壓滅菌后待用。
使用前，在100 ml SOB培養(yǎng)基中加入1 ml 2M Mg2+ (終濃度為20mM)。
SOC培養(yǎng)基：
在SOB培養(yǎng)基中加入葡萄糖至終濃度為20 mM即為SOC培養(yǎng)基
3) 高壓滅菌的500 ml錐形瓶。
二、超級(jí)感受態(tài)制備方法：
1、將凍存的DH5α接種到2 ml SOB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)。
2、取1 ml培養(yǎng)液接種到100 ml SOB，37°C培養(yǎng)2~2.5 h，細(xì)菌濃度約為4 ~7×107CFU/ml或OD600值為0.5。每20~30 min測(cè)定1次OD600值。
3、將培養(yǎng)液分裝到2個(gè)離心管，每管50 ml，冰浴10-15 min.
4、 750-1000 g (2000-3000 rpm)，4°C離心12 min，完全去除液體，收集菌體。
5、每個(gè)離心管加入1 ml TB，用移液器輕柔吹打重懸菌體。菌體完全分散后，每管再加入9ml TB，將兩管重懸液合為1管，冰浴15 min。
6、750-1000 g ，4°C離心收集菌體。
7、加入1 ml TB，用移液器輕柔吹打重懸菌體。菌體完全分散后，每管再加入7ml TB（終體積與原始菌液體積比為1:12.5）。
8、在8 ml重懸液中加入280μl DMSO冰浴15 min，分裝于預(yù)冷的離心管，每管100μl，在液氮中速凍，然后-70°C凍存?zhèn)溆谩?br />
三、注意事項(xiàng)
1、所用器具的潔凈程度。這一點(diǎn)非常重要，所有與感受態(tài)有關(guān)的方法與文章必強(qiáng)調(diào)這一點(diǎn)，其重要性毋庸置疑。
2、培養(yǎng)基的裝量。培養(yǎng)基的裝量是很重要的，這關(guān)系到菌體生長(zhǎng)過程中的能量代謝問題，是有氧還是無氧生長(zhǎng)。厭氧生長(zhǎng)出來的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的。建議裝量不要高于此值：培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。
3、培養(yǎng)基的pH值。pH值并非單指配制或滅菌后的pH值，而且還包括整個(gè)搖瓶結(jié)束后的pH值。一般來說，接種前的pH值在6.8-7.2。等菌搖好后，可以測(cè)一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，按要求做，肯定效率不低。
4、培養(yǎng)后的OD值。這是一個(gè)非常重要的參數(shù)，只是當(dāng)OD值達(dá)到一定的程度后，菌體要保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)已經(jīng)不太可能，因此很多指導(dǎo)方法上強(qiáng)調(diào)OD不得大于 0.6、0.8等等。同時(shí)，OD值大時(shí)菌體總量大，感受態(tài)絕對(duì)數(shù)量要大一點(diǎn)。因此需要在OD值的兩方面影響中找一個(gè)平衡點(diǎn)。
5、培養(yǎng)基中的各種離子。當(dāng)培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2+離子時(shí)，該方法制得的感受態(tài)效率相對(duì)較高。在制備普通感受時(shí)，使用20mM MgCl2做為培養(yǎng)基的添加物，在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入，會(huì)收到很好的效果。
6、培養(yǎng)溫度。較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成，可以獲得較高的感受態(tài)，但太低又不實(shí)用。
7、在保存感受態(tài)時(shí)，DMSO要比甘油的效果要好，能顯著增加感受態(tài)的效率。
8、液氮速凍也會(huì)增加感受態(tài)的效率，因此推薦用液氮速凍感受態(tài)，然后保存于超低溫冰箱內(nèi)。