可溶性抗原與相應(yīng)抗體持異性結(jié)合，兩者比例適當(dāng)并有電解質(zhì)存在及一定的溫度條件下，經(jīng)一定的時(shí)間，可形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)(precipitation)。沉淀反應(yīng)的抗原可以是多糖、蛋白質(zhì)、類脂等。與相應(yīng)的抗體相比，抗原分子小(<20pm) ，單位體積中所含抗原量多，具有較大的反應(yīng)面積。為了使抗原抗體之間比例適合，不使抗原過剩，故一般均應(yīng)稀釋抗原，并以抗原最高稀釋度仍能與抗體出現(xiàn)沉淀反應(yīng)為該抗體的沉淀反應(yīng)效價(jià) (滴度)。
瓊脂擴(kuò)散(agar diffusion)為可溶性抗原與抗體在瓊脂凝膠中所呈現(xiàn)的一種沉淀反應(yīng)。當(dāng)對應(yīng)的抗原、抗體在半固體瓊脂終相遇，且二者比例適當(dāng)時(shí)，便出現(xiàn)可見的白色沉淀線，這組沉淀線是一組抗原、抗體的特異性復(fù)合物。當(dāng)瓊脂中有多組不同的抗原、抗體存在時(shí)，便各自依其擴(kuò)散速度的差異，再適當(dāng)?shù)牟课恍纬瑟?dú)立的沉淀線。因此，瓊脂擴(kuò)散不僅用于疾病的診斷，更廣泛地用于抗原成分的分析。
免疫瓊脂雙向擴(kuò)散是將可溶性抗原和抗體分別加到瓊脂板上相應(yīng)的小孔中，兩者各自向四周擴(kuò)散，如抗原與抗體相對應(yīng)，兩者相遇即發(fā)生待異性結(jié)合，并在比例適合處形成白色沉淀線(圖1)。如果所加抗原和抗體標(biāo)本中分別含有若干與血清學(xué)反應(yīng)無關(guān)的抗原抗體，則因各種抗原的擴(kuò)散系數(shù)和各對抗原抗體間的最適比例不同，以及抗原抗體復(fù)合物所形成的沉淀線具有選擇性滲透屏障作用，擴(kuò)散后可以形成若干條沉淀線，—條沉淀線代表一對抗原抗體。因此，通過雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，用已知抗體(或抗原)檢測未知抗原(或抗體)，可鑒定抗原性物質(zhì)或免疫血清的濃度、純度及比較抗原之間的異同點(diǎn)。
一、試驗(yàn)材料
1、1%生理鹽水瓊脂。
2、人血清( 1:20 )，兔抗人IgG。
3、載玻片、瓊脂板打孔器、微量加樣器等。
二、實(shí)驗(yàn)方法
1、瓊脂板的制備：將載玻片置于水平桌面上，取已溶化的鹽水瓊脂4ml，傾注于載玻片上，使其自然流成水平面。待瓊脂凝固后，用打孔器按圖2打孔，孔徑3mm，孔距距15mm。
2、加樣：于中央孔加入人血清（抗原），周圍1-5孔加入不同濃度的兔抗人IgG（抗體），6孔加入生理鹽水作對照。
3、擴(kuò)散：將瓊脂板放入濕盒內(nèi)，置37°C溫箱中24小時(shí)后取出觀察結(jié)果。
三、結(jié)果觀察
觀察孔間沉淀線的數(shù)目及特征。本試驗(yàn)1-5孔( 1:2、1:4、1:8、1:16和1:32的人抗兔IgG)與中央孔(人血清)之間可出現(xiàn)清晰的乳白色沉淀線(圖3)沉淀線。沉淀線與中央孔的距離隨抗原的濃度減小而增大。
四、注意事項(xiàng)
1、加樣時(shí)不要將瓊脂劃破，以免影響沉淀線的形成。
2、反應(yīng)時(shí)間要適宜，時(shí)間過長，沉淀線可解離而導(dǎo)致假陰性、不出現(xiàn)或不清楚。
3、加樣時(shí)不同濃度抗體和抗原不要混淆，影響試驗(yàn)結(jié)果。
4、試驗(yàn)前應(yīng)做預(yù)試驗(yàn)，確定抗體的稀釋度。