蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)之蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)快速篩選法！
小楊 / 2026-02-09 09:33:56
蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）產(chǎn)毒菌株快速初篩方法，核心原理是蠟樣芽胞桿菌在適宜條件下形成芽胞時(shí)，會(huì)同步產(chǎn)生蛋白質(zhì)性伴胞晶體毒素（與芽胞緊密相連），經(jīng)涂片、染色后可在顯微鏡下觀察到特征性結(jié)晶形態(tài)，以此判斷是否為產(chǎn)毒株。
一、試驗(yàn)原理
蠟樣芽胞桿菌產(chǎn)毒株：芽胞 + 菱形/方形/不規(guī)則蛋白質(zhì)結(jié)晶 伴生存在。
非產(chǎn)毒株/其他芽胞桿菌：僅有芽胞，無(wú)特征性蛋白質(zhì)結(jié)晶。
染色后：結(jié)晶呈無(wú)色透明/淡藍(lán)色，芽胞呈綠色，菌體呈紅色（常用孔雀綠 - 石炭酸復(fù)紅染色）。
二、適用范圍
食品（米飯、淀粉類、乳制品、肉制品）中
蠟樣芽胞桿菌產(chǎn)毒菌株快速篩查
實(shí)驗(yàn)室分離株初步毒力判定（僅初篩，確診需結(jié)合生化、PCR、毒素 ELISA 等）
三、試劑與材料
培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面/平板（或改良 MYP 瓊脂純化后）
染色液：
孔雀綠染液（5%）
石炭酸復(fù)紅染液（0.5%）
器材：載玻片、接種環(huán)、酒精燈、顯微鏡（油鏡 100×）、水浴箱
四、操作步驟（標(biāo)準(zhǔn)流程）
1、菌株培養(yǎng)（關(guān)鍵：促芽胞 + 結(jié)晶形成）
挑取純培養(yǎng)菌落，接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面
30℃ 培養(yǎng) 18~24h（部分菌株需延長(zhǎng)至 36~48h）
培養(yǎng)溫度過(guò)高/時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低結(jié)晶檢出率
2、制片
載玻片滴加少量無(wú)菌生理鹽水，取菌苔混勻涂成薄菌膜
自然風(fēng)干，火焰固定（輕過(guò) 2~3 次，避免過(guò)熱破壞結(jié)晶）
3、染色（芽胞 - 結(jié)晶復(fù)合染色）
滴加5% 孔雀綠染液，覆蓋菌膜
酒精燈微熱維持冒蒸汽 3~5min（勿煮沸、勿干涸，及時(shí)補(bǔ)染液）
4、水洗去浮色
滴加0.5% 石炭酸復(fù)紅復(fù)染 30~60s
流水輕洗，吸水紙吸干，油鏡鏡檢
五、結(jié)果判定（油鏡 100× 觀察）
1、陽(yáng)性（產(chǎn)毒蠟樣芽胞桿菌）
可見(jiàn)大量圓形/橢圓形綠色芽胞
芽胞旁/菌體旁出現(xiàn)無(wú)色透明、菱形、方形、短棒狀蛋白質(zhì)結(jié)晶
結(jié)晶邊界清晰，與芽胞伴生為典型特征
2、陰性
僅有綠色芽胞、紅色菌體，無(wú)特征性蛋白質(zhì)結(jié)晶
六、注意事項(xiàng)（影響結(jié)果關(guān)鍵）
培養(yǎng)條件：30℃優(yōu)于 37℃，18~24h 最佳，溫度/時(shí)間不當(dāng)結(jié)晶易消失。
加熱固定：不可過(guò)度加熱，否則結(jié)晶變形、溶解。
染色控制：孔雀綠加熱僅需蒸汽，不可沸騰；復(fù)染時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。
形態(tài)鑒別：
排除培養(yǎng)基結(jié)晶、鹽類結(jié)晶（無(wú)規(guī)律、不與芽胞伴生）
初篩定位：本試驗(yàn)為形態(tài)學(xué)快速篩查，不能單獨(dú)作為確診依據(jù)，需結(jié)合：
溶血試驗(yàn)（β 溶血）
生化鑒定（甘露醇、卵磷脂酶、硝酸鹽還原等）
分子/免疫學(xué)毒素檢測(cè)（hbl、nhe、ces 基因；嘔吐/腹瀉毒素 ELISA）
七、結(jié)果報(bào)告模板
陽(yáng)性：檢出蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶，提示為產(chǎn)毒型蠟樣芽胞桿菌（需進(jìn)一步確證）
陰性：未檢出蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶，暫不提示產(chǎn)毒（不排除低產(chǎn)毒/非產(chǎn)毒株）
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