實(shí)驗(yàn)室生化鑒定方法的準(zhǔn)備工作與操作步驟及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2026-02-09 10:02:41
一、前期準(zhǔn)備
1、菌株純化
取待檢菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂/血瓊脂，35±2℃培養(yǎng) 18–24 h，確保為純單菌落。
2、試劑與培養(yǎng)基準(zhǔn)備
準(zhǔn)備所需生化管（糖發(fā)酵、尿素、枸櫞酸鹽、MIU、TSI 等）、生化試劑（吲哚試劑、V-P 試劑、甲基紅等）。
檢查培養(yǎng)基是否過期、渾濁、污染、褪色。
3、器材準(zhǔn)備
接種環(huán)/接種針、酒精燈、試管架、恒溫培養(yǎng)箱、生理鹽水、玻片等。
二、核心操作步驟（通用流程）
1、接種（關(guān)鍵：無菌操作）
點(diǎn)燃酒精燈，在火焰無菌區(qū)操作。
用接種環(huán)挑取新鮮純培養(yǎng)單菌落。
按試驗(yàn)類型接種：
液體生化管：接種環(huán)蘸取菌苔，在液面下輕輕旋轉(zhuǎn)混勻。
半固體（動(dòng)力、MIU）：垂直穿刺接種，直達(dá)管底，不要攪動(dòng)。
斜面（枸櫞酸鹽、尿素斜面）：沿斜面自下而上劃線。
高層斜面（TSI）：先穿刺底層，再劃線斜面。
2、培養(yǎng)條件
一般：35±2℃ 需氧/兼性厭氧培養(yǎng) 18–24 h
慢生長菌：可延長至 48 h
嚴(yán)格按培養(yǎng)基要求，不隨意改變溫度與時(shí)間
3、結(jié)果觀察與判讀
培養(yǎng)后按項(xiàng)目依次觀察：
顏色變化（產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、指示劑變色）
氣體（倒管氣泡、培養(yǎng)基裂開）
沉淀/變黑（H?S）
渾濁度（動(dòng)力）
需加試劑的試驗(yàn)：按順序添加試劑后再判讀
原則：先看自然變化，再加顯色試劑，避免干擾。
4、典型試驗(yàn)簡要操作（快速對(duì)照）
（1）糖發(fā)酵試驗(yàn)
接種糖發(fā)酵管 → 培養(yǎng) → 觀察：
變黃 = 產(chǎn)酸陽性
倒置杜氏管有氣泡 = 產(chǎn)氣陽性
（2）MIU（動(dòng)力 + 吲哚 + 尿素）三聯(lián)管
穿刺接種 → 培養(yǎng)
先看動(dòng)力：沿穿刺線擴(kuò)散渾濁 = 陽性
加吲哚試劑：上層出現(xiàn)玫瑰紅色環(huán) = 吲哚陽性
看尿素：變紅 = 陽性
（3）MR-VP 試驗(yàn)
接種葡萄糖蛋白胨水 → 培養(yǎng)
MR：加甲基紅 → 紅色 = 陽性
VP：加 VP 甲液 + 乙液 → 靜置 10–30min，出現(xiàn)紅色 = 陽性
（4）枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)
接種斜面 → 培養(yǎng) → 斜面由綠變藍(lán) = 陽性
（5）TSI（三糖鐵）
先穿刺底層，再劃斜面 → 培養(yǎng)
觀察：
斜面/底層顏色（產(chǎn)酸/產(chǎn)堿）
是否產(chǎn)氣（裂開、上升）
是否變黑（H?S）
（6）氧化酶試驗(yàn)（快速試驗(yàn)，不需培養(yǎng)）
濾紙片滴氧化酶試劑 → 涂菌落 → 10 秒內(nèi)變藍(lán)紫 = 陽性
（7）觸酶試驗(yàn)
玻片滴 3% H?O? → 涂菌落 → 立即產(chǎn)生氣泡 = 陽性
三、結(jié)果記錄與編碼
按試驗(yàn)項(xiàng)目逐一記錄：+（陽性）、-（陰性）、±（弱陽）、產(chǎn)氣、H?S 等。
若使用微量生化鑒定板（API/VITEK）：
按孔位顏色判讀 → 生成數(shù)字編碼 → 查編碼手冊(cè)或軟件 → 得出菌名。
四、質(zhì)量控制（必須做）
每批試驗(yàn)同步做陽性對(duì)照菌 + 陰性對(duì)照菌。
對(duì)照結(jié)果必須符合標(biāo)準(zhǔn)，待檢菌結(jié)果才有效。
培養(yǎng)基、試劑過期、污染、變色均棄用。
五、完整通用步驟（極簡總結(jié)版，考試直接背）
純培養(yǎng)：獲得新鮮單菌落
無菌接種：按試驗(yàn)類型穿刺/劃線/接種液體
恒溫培養(yǎng)：35℃ 18–24 h
觀察基礎(chǔ)現(xiàn)象：顏色、氣體、渾濁、沉淀
添加試劑：吲哚、MR、VP 等
判讀結(jié)果：陽性/陰性/產(chǎn)氣/H?S 等
記錄生化譜，對(duì)照編碼表鑒定菌種
質(zhì)控驗(yàn)證，確認(rèn)結(jié)果可靠
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