高鹽察氏瓊脂培養(yǎng)基的核心原理與使用方法及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-12-23 09:44:03
高鹽察氏瓊脂培養(yǎng)基（High-Salt Czapek Dox Agar）是一種選擇性培養(yǎng)基，主要用于從含菌量高的樣品中分離和純化耐高滲透壓的真菌，尤其對(duì)常見(jiàn)污染菌——
曲霉菌（Aspergillus）和
青霉菌（Penicillium）有良好的選擇性，同時(shí)能抑制大部分細(xì)菌和不耐鹽真菌的生長(zhǎng)。
一、培養(yǎng)基核心原理
高鹽察氏瓊脂的選擇性和營(yíng)養(yǎng)供給功能，基于以下 3 個(gè)關(guān)鍵設(shè)計(jì)：
1、高鹽濃度：實(shí)現(xiàn)選擇性抑制
培養(yǎng)基中添加7.5%-10% 的氯化鈉（NaCl），創(chuàng)造高滲透壓環(huán)境：
抑制作用：大部分細(xì)菌（如
大腸桿菌、
葡萄球菌）和普通真菌（如
酵母菌）的細(xì)胞膜滲透壓調(diào)節(jié)能力較弱，高鹽會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞脫水、蛋白質(zhì)變性，最終無(wú)法生長(zhǎng)；
選擇作用：
曲霉菌、
青霉菌等耐高滲透壓真菌，能通過(guò)合成“相容性溶質(zhì)”（如脯氨酸、甘油）調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透壓，適應(yīng)高鹽環(huán)境，因此可正常萌發(fā)和繁殖。
2、察氏基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)：滿(mǎn)足目標(biāo)真菌生長(zhǎng)
察氏（Czapek Dox）是經(jīng)典的真菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方，提供真菌生長(zhǎng)所需的碳、氮、礦物質(zhì)：
成分 作用
蔗糖 碳源：真菌代謝的主要能量來(lái)源，支持菌絲生長(zhǎng)和孢子形成
硝酸鈉（NaNO?） 氮源：提供合成蛋白質(zhì)、核酸的原料，促進(jìn)真菌細(xì)胞增殖
磷酸二氫鉀（KH?PO?） 磷源 + 緩沖劑：維持培養(yǎng)基 pH 穩(wěn)定（通常 pH 5.5-6.0，適合真菌生長(zhǎng)）
硫酸鎂（MgSO??7H?O） 鎂離子：作為酶的輔酶，參與碳水化合物代謝
氯化鉀（KCl） 鉀離子：維持細(xì)胞滲透壓和酶活性
硫酸亞鐵（FeSO??7H?O） 鐵離子：參與細(xì)胞色素合成，輔助能量代謝
3、瓊脂：凝固劑
添加 1.5%-2% 的瓊脂，使培養(yǎng)基在常溫下呈固體狀態(tài)，便于真菌形成孤立的菌落（單個(gè)菌落來(lái)自單個(gè)孢子或菌絲片段），實(shí)現(xiàn)分離純化。
二、培養(yǎng)基配方（經(jīng)典配方，可按需調(diào)整）
以制備 1000mL 培養(yǎng)基為例，基礎(chǔ)成分及用量如下：
成分 用量 備注
氯化鈉（NaCl） 75-100g 高鹽核心，按目標(biāo)菌耐鹽性調(diào)整
蔗糖 30g 可替換為等質(zhì)量葡萄糖，碳源供給更快速
硝酸鈉（NaNO?） 2g 不可用氯化銨等替代（部分真菌不利用銨態(tài)氮）
磷酸二氫鉀（KH?PO?） 1g 調(diào)節(jié) pH 至 5.5-6.0，無(wú)需額外加酸堿
硫酸鎂（MgSO??7H?O） 0.5g 需用結(jié)晶水形式，避免濃度誤差
氯化鉀（KCl） 0.5g 微量礦物質(zhì)，不可省略
硫酸亞鐵（FeSO??7H?O） 0.01g 易氧化，建議配成母液后滅菌前加入
瓊脂 15-20g 按凝固硬度調(diào)整，夏季可適當(dāng)增加
蒸餾水 1000mL 避免用自來(lái)水（含氯、雜質(zhì)影響真菌生長(zhǎng)）
三、使用方法（含制備、滅菌、接種、培養(yǎng)全流程）
1、培養(yǎng)基制備（無(wú)菌操作前步驟）
溶解成分：先在燒杯中加入 800mL 蒸餾水，依次加入氯化鈉、蔗糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鉀，攪拌至完全溶解（高鹽可能需小火加熱助溶，但避免煮沸）；
添加微量元素：將硫酸亞鐵用 10mL 蒸餾水配成母液，過(guò)濾后加入上述溶液中（避免 Fe²+ 氧化成 Fe³+ 產(chǎn)生沉淀）；
定容與調(diào) pH：補(bǔ)加蒸餾水至 1000mL，用 pH 計(jì)檢測(cè) pH，若偏離 5.5-6.0，用 1mol/L HCl 或 NaOH 微調(diào)；
加瓊脂并融化：加入瓊脂，小火加熱并不斷攪拌（防止糊底），直至瓊脂完全融化（溶液澄清透明）；
分裝：將融化的培養(yǎng)基分裝至錐形瓶（每瓶不超過(guò)容積的 1/2，便于滅菌后搖勻），加棉塞或硅膠塞，外包牛皮紙。
2、滅菌（關(guān)鍵步驟，防止雜菌污染）
滅菌方式：采用高壓蒸汽滅菌，條件為 121℃、103.4kPa（1.05kg/cm²），維持 20 分鐘；
滅菌后處理：滅菌結(jié)束后，待壓力降至 0 時(shí)取出錐形瓶，輕輕搖勻（避免氣泡），放置于 50-60℃水浴中保溫（防止瓊脂凝固，便于倒平板）。
3、倒平板（無(wú)菌操作開(kāi)始）
無(wú)菌環(huán)境：在超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，先紫外線滅菌 30 分鐘，再開(kāi)風(fēng)機(jī)通風(fēng) 10 分鐘；
倒板操作：手持錐形瓶，拔去棉塞，瓶口過(guò)火焰滅菌（1-2 秒），向無(wú)菌培養(yǎng)皿（直徑 90mm）中倒入約 20mL 培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿倒?jié)M 1/3-1/2 即可；
凝固：蓋上皿蓋，水平放置于超凈臺(tái)內(nèi)，待培養(yǎng)基自然冷卻凝固（約 30 分鐘，避免移動(dòng)導(dǎo)致表面不平整），標(biāo)記培養(yǎng)基名稱(chēng)、制備日期。
4、樣品接種（分離目標(biāo)真菌）
根據(jù)樣品類(lèi)型選擇接種方法，核心是讓樣品均勻分布在培養(yǎng)基表面，形成孤立菌落：
固體樣品（如食品、土壤）：
取 10g 樣品，加入 90mL 無(wú)菌生理鹽水，振蕩 10 分鐘制成 1:10 稀釋液；
按 10 倍梯度稀釋?zhuān)?:100、1:1000…），選擇 3 個(gè)適宜稀釋度（如 1:100-1:10000）；
每個(gè)稀釋度取 0.1mL 稀釋液，滴加在培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌涂布棒將液體均勻涂滿(mǎn)整個(gè)平板（涂布棒需先過(guò)火焰滅菌，冷卻后使用）。
液體樣品：直接取 0.1-0.2mL 樣品，涂布于培養(yǎng)基表面即可。
純培養(yǎng)轉(zhuǎn)接：若需純化已分離的真菌，用無(wú)菌接種針挑取單個(gè)菌落，在新的高鹽察氏瓊脂平板上劃線（如三區(qū)劃線法），避免菌落重疊。
5、培養(yǎng)與觀察
培養(yǎng)條件：置于25-28℃恒溫培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)（部分真菌對(duì)光敏感，影響孢子形成）；
培養(yǎng)時(shí)間：根據(jù)真菌生長(zhǎng)速度調(diào)整，一般為 5-7 天（
曲霉菌、
青霉菌通常 3-5 天可見(jiàn)菌落，慢生菌需延長(zhǎng)至 10 天）；
菌落識(shí)別：
曲霉菌：菌落較大，呈絨毛狀或棉絮狀，表面有顏色（如黃曲霉素為黃色、黑曲霉為黑色），背面有色素?cái)U(kuò)散；
青霉菌：菌落較小，呈絨狀，多為青綠色，背面無(wú)色或淡黃色；
雜菌：若出現(xiàn)黏液狀（細(xì)菌）、乳白色光滑菌落（
酵母菌），說(shuō)明滅菌不徹底或操作污染，需重新實(shí)驗(yàn)。
6、后續(xù)處理
純化：挑取目標(biāo)真菌的單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)接至新鮮的高鹽察氏瓊脂斜面，25℃培養(yǎng) 5 天，制成斜面菌種，4℃冰箱保存（可保存 1-3 個(gè)月）；
鑒定：通過(guò)顯微鏡觀察菌絲、孢子形態(tài)（如
曲霉菌有頂囊、
青霉菌有掃帚狀分生孢子梗），結(jié)合分子生物學(xué)方法確認(rèn)菌種。
四、注意事項(xiàng)
高鹽溶解問(wèn)題：氯化鈉溶解度較高，但大量添加時(shí)需充分?jǐn)嚢?，避免滅菌后出現(xiàn)鹽結(jié)晶（影響真菌生長(zhǎng)）；
滅菌時(shí)間控制：滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致蔗糖碳化（培養(yǎng)基變黑），影響碳源供給，需嚴(yán)格控制 20 分鐘；
無(wú)菌操作：倒平板、接種時(shí)必須在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，避免空氣中的雜菌污染，導(dǎo)致分離失敗；
樣品稀釋度：若樣品含菌量高，需提高稀釋度，避免菌落密集重疊；若含菌量低，可直接涂樣或增加取樣量；
pH 控制：真菌對(duì) pH 敏感，pH 過(guò)高（>6.5）會(huì)促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，pH 過(guò)低（<5.0）會(huì)抑制部分曲霉菌，需嚴(yán)格調(diào)至 5.5-6.0。
通過(guò)以上原理和方法，高鹽察氏瓊脂可高效分離環(huán)境中的耐高滲真菌，是食品衛(wèi)生檢測(cè)、環(huán)境微生物學(xué)研究的常用培養(yǎng)基。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的
微生物菌種查詢(xún)網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測(cè)序、購(gòu)買(mǎi)等服務(wù),是中國(guó)微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺(tái)，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢(xún)類(lèi)網(wǎng)站，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶(hù)來(lái)詢(xún)！
下載附件
上一篇：瑞氏染色液的質(zhì)控要點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)操作及常見(jiàn)問(wèn)題與優(yōu)化策略！
下一篇：微生物純種培養(yǎng)的核心方法之劃線、涂布及傾注分離法！