微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株的制備方法與操作流程及要點(diǎn)！
小楊 / 2025-12-20 10:46:05
百歐博偉生物：微生物實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株是用于方法驗(yàn)證、培養(yǎng)基適用性檢查、儀器校準(zhǔn)、人員操作考核的核心材料，其制備需遵循標(biāo)準(zhǔn)化、可溯源、無污染的原則，全程嚴(yán)格控制污染風(fēng)險(xiǎn)，保證菌株活性與穩(wěn)定性。以下是完整的制備流程、關(guān)鍵操作要點(diǎn)及質(zhì)量控制要求。
一、核心原則與菌株來源
菌株溯源性質(zhì)控菌株需來自權(quán)威機(jī)構(gòu)，如中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)（CGMCC）、美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）、歐洲菌種保藏中心（DSMZ）等，需具備明確的菌株編號、種屬名稱、特性描述及傳代次數(shù)記錄。嚴(yán)禁使用臨床分離的未鑒定菌株或來源不明菌株作為質(zhì)控菌株。
傳代控制標(biāo)準(zhǔn)菌株的傳代次數(shù)不宜超過 5 代（從原始凍干菌株復(fù)蘇后為第 1 代），避免因多次傳代導(dǎo)致菌株的生理生化特性、耐藥性等發(fā)生變異。
二、制備流程（以細(xì)菌為例）
（一）菌株復(fù)蘇
材料準(zhǔn)備
試劑：無菌生理鹽水、適配的液體培養(yǎng)基（如營養(yǎng)肉湯 NB、胰酪大豆胨肉湯 TSB）、固體培養(yǎng)基（如營養(yǎng)瓊脂 NA、胰酪大豆胨瓊脂 TSA）。
耗材：無菌離心管、移液管、接種環(huán)、酒精燈、無菌培養(yǎng)皿。
儀器：超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌器。
操作步驟
超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無菌接種環(huán)或移液槍吸取適量無菌生理鹽水，注入凍干菌株的安瓿瓶中，輕輕振蕩使凍干粉末完全溶解。
吸取菌懸液，接種至液體培養(yǎng)基中，置于菌株最適溫度下振蕩培養(yǎng)（如細(xì)菌 35±2℃，培養(yǎng) 16-24h；真菌 25±2℃，培養(yǎng) 48-72h）。
取培養(yǎng)后的菌液，劃線接種至固體培養(yǎng)基平板，進(jìn)行純化培養(yǎng)，獲得單菌落。
挑取形態(tài)典型的單菌落，再次劃線純化，確保菌株無雜菌污染。
（二）菌株鑒定與特性驗(yàn)證
復(fù)蘇后的菌株需進(jìn)行確認(rèn)鑒定，保證其與標(biāo)準(zhǔn)菌株的特性一致，避免復(fù)蘇錯(cuò)誤或污染。
形態(tài)學(xué)鑒定：觀察菌落形態(tài)（大小、顏色、邊緣、隆起度）、革蘭染色或芽孢染色后的鏡下形態(tài)。
生化鑒定：針對目標(biāo)菌株，選擇特異性生化試驗(yàn)（如腸桿菌科的 IMViC 試驗(yàn)、葡萄球菌的血漿凝固酶試驗(yàn)）。
特異性驗(yàn)證：若為致病菌（如
沙門氏菌、
金黃色葡萄球菌），需通過血清學(xué)試驗(yàn)（如玻片凝集試驗(yàn)）或分子生物學(xué)方法進(jìn)一步確認(rèn)。
（三）菌懸液制備與濃度標(biāo)定
菌懸液制備
挑取純化后的單菌落，接種至液體培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期（此時(shí)菌株活性最強(qiáng)，穩(wěn)定性最好）。
取培養(yǎng)后的菌液，4000r/min 離心 10min，棄上清液，用無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）重懸菌體，洗滌 2-3 次，去除培養(yǎng)基殘留。
用無菌生理鹽水/ PBS 調(diào)整菌懸液濃度，制成工作菌懸液（用于日常質(zhì)控）或儲(chǔ)備菌懸液（用于長期保藏）。
濃度標(biāo)定（平板計(jì)數(shù)法）
對菌懸液進(jìn)行10 倍系列稀釋（如 10?¹、10?²……10??），選擇 3 個(gè)適宜稀釋度。
取每個(gè)稀釋度的菌液 0.1mL，涂布于固體培養(yǎng)基平板，每個(gè)稀釋度做 3 個(gè)平行。
培養(yǎng)后計(jì)數(shù)單菌落數(shù)，計(jì)算菌懸液的濃度（CFU/mL）：
濃度= 涂布體積 平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)
?
（四）分裝與保藏
根據(jù)使用需求，將標(biāo)定后的菌懸液分為工作用菌株和保藏用菌株兩類，分別處理。
類型 保藏方法 操作要點(diǎn) 保存期限
工作用菌株 斜面保藏法 將菌懸液接種至固體培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)后密封試管，4℃冷藏 1-3 個(gè)月
保藏用菌株 甘油凍存法 菌懸液與 50% 無菌甘油按 1:1 體積混合，終甘油濃度 20%-30%，分裝至凍存管，-70℃ 或液氮保存 1-3 年
保藏用菌株 凍干保藏法 （適用于長期保藏）將菌懸液與保護(hù)劑混合，凍干后密封安瓿瓶，4℃保存 5-10 年
三、全程質(zhì)量控制要點(diǎn)
1、無菌控制
所有耗材、培養(yǎng)基需經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121℃，15-20min）或過濾除菌；超凈工作臺(tái)使用前需紫外照射 30min 消毒。
操作全程嚴(yán)格遵循無菌操作規(guī)范，避免雜菌污染；每批次制備需設(shè)置空白對照（未接種的培養(yǎng)基同步培養(yǎng)，觀察是否有菌落生長）。
2、穩(wěn)定性監(jiān)測
保藏的菌株需定期復(fù)蘇驗(yàn)證：斜面保藏菌株每月復(fù)蘇 1 次，甘油凍存菌株每 6 個(gè)月復(fù)蘇 1 次，檢查菌株的形態(tài)、生化特性是否穩(wěn)定。
若發(fā)現(xiàn)菌株特性變異，立即停止使用，重新從原始標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇。
標(biāo)識管理所有菌株管/斜面需清晰標(biāo)注菌株名稱、編號、傳代次數(shù)、制備日期、保存條件、有效期，避免混淆。
3、安全管理
致病性質(zhì)控菌株（如
霍亂弧菌、
炭疽芽孢桿菌）的制備需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，遵循相應(yīng)生物安全等級要求。
廢棄菌液、培養(yǎng)基需經(jīng)高壓滅菌后處理，防止生物危害。
四、常見問題及解決方案
常見問題 原因分析 解決方案
凍干菌株復(fù)蘇失敗 安瓿瓶開啟時(shí)污染；菌株凍存時(shí)間過長；培養(yǎng)基不適配 嚴(yán)格無菌操作；選擇保質(zhì)期內(nèi)的菌株；更換適配的培養(yǎng)基
菌懸液濃度偏低 菌株培養(yǎng)未達(dá)對數(shù)期；離心洗滌時(shí)菌體損失過多 優(yōu)化培養(yǎng)條件至對數(shù)生長期；降低離心轉(zhuǎn)速或縮短離心時(shí)間
菌株特性變異 傳代次數(shù)過多；保存溫度不當(dāng) 控制傳代次數(shù)≤5 代；嚴(yán)格按照推薦溫度保藏
雜菌污染 操作過程無菌控制不足；培養(yǎng)基滅菌不徹底 加強(qiáng)無菌操作；培養(yǎng)基滅菌后進(jìn)行無菌性檢查
五、應(yīng)用場景
制備好的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株主要用于：
培養(yǎng)基適用性檢查：驗(yàn)證培養(yǎng)基的促生長能力、選擇性和指示特性。
方法驗(yàn)證：如食品微生物檢驗(yàn)中，驗(yàn)證致病菌分離檢測方法的靈敏度和特異性。
儀器校準(zhǔn)：如菌落計(jì)數(shù)器、自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)的性能校準(zhǔn)。
人員考核：評估實(shí)驗(yàn)人員的接種、分離、鑒定操作能力。
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