厭氧肉肝湯培養(yǎng)基的配制、培養(yǎng)及使用注意事項有哪些？
小楊 / 2025-12-20 10:02:02
厭氧肉肝湯培養(yǎng)基的使用核心是維持嚴格厭氧環(huán)境、保證營養(yǎng)有效性、避免雜菌污染，以下是分模塊的詳細注意事項，覆蓋配制、滅菌、保存、接種、培養(yǎng)全流程，兼顧實操性和問題規(guī)避：
一、配制過程注意事項
1、成分處理與比例準(zhǔn)確性
肝浸液需新鮮制備：選擇無病變、無脂肪的新鮮牛肝/豬肝，絞碎后按 1:2（肝：蒸餾水）比例 80℃水浴 1h，經(jīng) 3 層紗布過濾后立即使用，避免放置過久導(dǎo)致營養(yǎng)成分降解，影響苛養(yǎng)厭氧菌生長。
還原劑添加時機：L - 半胱氨酸鹽酸鹽需在滅菌前加入培養(yǎng)基，不可高溫滅菌后補加（高溫會導(dǎo)致其氧化失效）；若需補加，需經(jīng) 0.22μm 無菌濾膜過濾除菌后，在培養(yǎng)基冷卻至 50℃以下時無菌加入。
葡萄糖避免焦化：溶解葡萄糖時用小火加熱攪拌，勿煮沸過度，防止葡萄糖焦化產(chǎn)生有毒物質(zhì)抑制菌體生長。
2、pH 調(diào)節(jié)關(guān)鍵要點
調(diào)節(jié) pH 前需將培養(yǎng)基冷卻至室溫（高溫下 pH 測量偏差較大），目標(biāo) pH 嚴格控制在 7.2~7.6（厭氧菌最適生長范圍），偏酸（<7.0）或偏堿（>8.0）都會抑制厭氧菌增殖。
若肝浸液本身 pH 偏低，可適當(dāng)減少鹽酸用量，優(yōu)先用磷酸緩沖對微調(diào)，避免過度依賴 NaOH 導(dǎo)致滲透壓異常。
3、分裝操作規(guī)范
按每管 10~15mL 分裝，試管高度選擇 15cm 左右（液面高度約 8~10cm），便于后續(xù)穿刺接種至深層（厭氧環(huán)境更穩(wěn)定）。
分裝后試管蓋不要擰緊，留少量縫隙（滅菌時排出空氣，避免試管炸裂），滅菌后冷卻前再擰緊。
二、滅菌與厭氧層制備注意事項
1、滅菌參數(shù)控制
采用 121℃高壓蒸汽滅菌 15min，不可延長滅菌時間（超過 20min 會破壞肝浸液中的熱不穩(wěn)定營養(yǎng)成分），也不可降低溫度（導(dǎo)致滅菌不徹底，增加污染風(fēng)險）。
滅菌后立即取出，垂直放置冷卻，避免培養(yǎng)基掛壁過多影響后續(xù)接種。
2、液體石蠟層處理
液體石蠟需單獨 121℃滅菌 15min，冷卻后備用，不可使用未滅菌的石蠟（直接引入雜菌）。
待培養(yǎng)基冷卻至 50℃左右（不燙手）時加入石蠟，用量以覆蓋液面 1~2cm 為宜（過薄無法有效隔絕氧氣，過厚不便接種），加入后輕輕倒置試管 1~2 次（使石蠟與培養(yǎng)基界面貼合，避免氣泡殘留）。
若使用石蠟混合物（1:1），需加熱融化后無菌加入，冷卻后形成更穩(wěn)定的密封層，但接種時需用無菌接種針刺破密封層。
三、保存與使用前檢查注意事項
1、保存條件
滅菌后密封的培養(yǎng)基需置于 4℃冰箱避光保存，有效期 1 個月，不可冷凍（會破壞培養(yǎng)基膠體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致營養(yǎng)成分析出）。
保存期間定期檢查：若出現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁、變色（如變黃、變黑）、液面石蠟層破損或有氣泡進入，需立即廢棄。
2、使用前準(zhǔn)備
從冰箱取出后，室溫放置 30min（避免溫差過大導(dǎo)致接種后菌體應(yīng)激），同時檢查厭氧狀態(tài)：培養(yǎng)基應(yīng)為澄清透明或輕微渾濁（正常肝浸液帶來的輕微渾濁），若出現(xiàn)明顯渾濁或沉淀，提示污染。
若需增強厭氧效果，可在接種前將培養(yǎng)基置于 37℃厭氧培養(yǎng)箱中預(yù)熱 30min，排出殘留氧氣。
四、接種與培養(yǎng)注意事項
1、接種操作規(guī)范
嚴格無菌操作：接種針/吸管需經(jīng)火焰滅菌并冷卻（避免燙傷菌體），接種時避免刺破液體石蠟層（防止空氣進入培養(yǎng)基），沿試管壁穿刺至培養(yǎng)基深層（深層厭氧環(huán)境更穩(wěn)定），接種后立即擰緊試管蓋。
樣本量控制：液體樣本接種量為培養(yǎng)基體積的 1/10（如 15mL 培養(yǎng)基接種 1.5mL 樣本），固體樣本需研磨后取上清接種，避免固體顆粒堵塞接種針或影響菌體擴散。
避免交叉污染：不同樣本接種時需更換接種工具，接種后在試管上清晰標(biāo)記樣本信息（編號、接種日期、樣本類型）。
2、培養(yǎng)條件控制
培養(yǎng)溫度：絕大多數(shù)厭氧菌最適溫度為 35~37℃，不可高于 40℃（會導(dǎo)致菌體死亡）或低于 30℃（生長緩慢）。
厭氧環(huán)境強化：若使用厭氧罐培養(yǎng)，需加入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋（如含焦性沒食子酸的產(chǎn)氣袋），并放入指示劑（如亞甲基藍，厭氧條件下呈無色，有氧時呈藍色），確保罐內(nèi)無氧；培養(yǎng)期間避免頻繁打開厭氧罐（引入氧氣）。
培養(yǎng)時間：常規(guī)厭氧菌培養(yǎng) 24~48h，苛養(yǎng)厭氧菌（如
脆弱擬桿菌、
產(chǎn)氣莢膜梭菌）需延長至 72h，不可過早觀察結(jié)果（導(dǎo)致假陰性）。
五、結(jié)果觀察與后續(xù)處理注意事項
1、結(jié)果觀察要點
觀察指標(biāo)：培養(yǎng)基渾濁度（輕微→中度→重度渾濁，提示菌體增殖）、產(chǎn)氣情況（試管內(nèi)出現(xiàn)氣泡，部分厭氧菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣）、沉淀形成（部分厭氧菌生長后會產(chǎn)生沉淀）。
排除干擾：若未接種樣本的空白對照培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，提示培養(yǎng)基本身污染，需重新配制；若接種后無生長，需結(jié)合陽性對照（如接種
脆弱擬桿菌 ATCC 25285）判斷是培養(yǎng)基問題還是樣本中無厭氧菌。
2、后續(xù)分離純化注意事項
若增菌后需分離單菌落，需在厭氧環(huán)境下操作：用無菌接種針吸取培養(yǎng)基深層的培養(yǎng)物，劃線接種至厭氧血瓊脂平板，避免暴露在空氣中時間過長（超過 5min 會導(dǎo)致厭氧菌死亡）。
接種后的平板需立即放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱/罐中，繼續(xù) 35~37℃培養(yǎng) 48h，觀察菌落形態(tài)并進行鑒定。
六、安全與污染防控注意事項
培養(yǎng)結(jié)束后，所有接種過的培養(yǎng)基、實驗器材需經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121℃，30min）后再處理，避免厭氧菌擴散污染環(huán)境或感染實驗人員。
若實驗過程中不慎打翻培養(yǎng)基，需立即用含氯消毒劑噴灑污染區(qū)域，作用 30min 后清理，同時通風(fēng)換氣（避免厭氧菌芽孢擴散）。
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