莢膜染色液的適用范圍與操作方法及結(jié)果判定與注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-12-12 09:47:02
百歐博偉生物：莢膜染色是微生物學(xué)中用于觀察細(xì)菌莢膜的常用技術(shù)，其核心原理是利用莢膜與染料的親和性差異，通過背景染色或負(fù)染色的方式使透明的莢膜顯現(xiàn)出來。以下是常用的
莢膜染色液（墨汁染色液、石炭酸復(fù)紅染色液）的使用方法及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。
一、常用莢膜染色液及適用范圍
染色液類型 組成 適用細(xì)菌 染色原理
墨汁染色液 優(yōu)質(zhì)墨汁 + 蒸餾水（或 PBS） 有厚莢膜的細(xì)菌（如
肺炎鏈球菌、
新型隱球菌） 負(fù)染色法：墨汁顆粒無(wú)法進(jìn)入莢膜，使背景呈黑色，莢膜為透明圈，菌體著色淺
石炭酸復(fù)紅-染色液 甲液（石炭酸復(fù)紅）、乙液（美藍(lán)） 多數(shù)有莢膜的細(xì)菌（如
炭疽芽孢桿菌） 正染色法：菌體被石炭酸復(fù)紅染成紅色，莢膜被美藍(lán)染成淺藍(lán)色或不著色，形成對(duì)比
二、操作方法（以墨汁染色法為例，最常用）
1、樣本制備
取新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌菌液（或液體培養(yǎng)基中的菌懸液），或挑取固體培養(yǎng)基上的菌落，與一滴生理鹽水在載玻片中央混勻，制成均勻的菌膜（避免過厚）。
若為臨床樣本，可直接取樣本涂片。
2、染色步驟
在菌膜處滴加 1 滴墨汁染色液，用接種環(huán)輕輕混勻，使墨汁與菌液充分融合。
取另一張載玻片作為推片，將推片邊緣與菌液接觸，呈 30°~45°角向一端勻速推動(dòng)，制成薄而均勻的涂片。
自然干燥（禁止加熱固定！加熱會(huì)破壞莢膜結(jié)構(gòu)）。
無(wú)需水洗，直接在顯微鏡下觀察。
3、石炭酸復(fù)紅 - 美藍(lán)染色法操作步驟
涂片自然干燥后，用酒精燈火焰快速通過 2~3 次（輕度固定，減少菌體脫落，避免高溫破壞莢膜）。
滴加石炭酸復(fù)紅染液，染色 2~3 min，水洗。
用美藍(lán)染液復(fù)染 30 s~1 min，水洗。
自然干燥后鏡檢。
三、結(jié)果判定
1、墨汁染色法結(jié)果
在黑色背景下，顯微鏡（油鏡）觀察可見：
菌體：呈淡紫色或無(wú)色的圓形/橢圓形小體（部分細(xì)菌可自身著色）；
莢膜：圍繞在菌體周圍的透明、中空的圈狀結(jié)構(gòu)，邊界清晰；
陽(yáng)性判定：菌體周圍出現(xiàn)明顯透明圈，即為莢膜陽(yáng)性；無(wú)透明圈則為莢膜陰性。
示例：新型隱球菌莢膜陽(yáng)性時(shí)，可見菌體位于透明圈中央，形似“光暈”。
2、石炭酸復(fù)紅 - 美藍(lán)染色法結(jié)果
菌體：被石炭酸復(fù)紅染成紅色；
莢膜：被美藍(lán)染成淺藍(lán)色或淡紫色，或因與染料親和性低而呈無(wú)色透明圈，與紅色菌體形成鮮明對(duì)比；
陽(yáng)性判定：菌體周圍有淺藍(lán)色圈或無(wú)色透明圈，即為莢膜陽(yáng)性。
四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
禁止加熱固定：莢膜是多糖或多肽類物質(zhì)，加熱會(huì)使其變性、收縮甚至消失，導(dǎo)致假陰性。
涂片要薄而均勻：涂片過厚會(huì)導(dǎo)致背景渾濁，無(wú)法區(qū)分莢膜與雜質(zhì)。
染色液濃度適宜：墨汁濃度過高會(huì)使背景過黑，掩蓋莢膜；濃度過低則背景反差不足。
選擇新鮮培養(yǎng)物：細(xì)菌莢膜的形成與培養(yǎng)條件相關(guān)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的細(xì)菌莢膜最明顯，老化培養(yǎng)物莢膜易脫落。
五、常見問題及解決辦法
問題 1：視野中無(wú)透明圈，疑似假陰性 → 原因：加熱固定、涂片過厚、培養(yǎng)物老化 → 解決：自然干燥、重新制備薄涂片、使用新鮮菌液。
問題 2：背景渾濁，無(wú)法分辨莢膜 → 原因：墨汁濃度過高、推片速度過慢 → 解決：稀釋墨汁、加快推片速度。
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