原代培養(yǎng)小鼠腎小管上皮細(xì)胞的具體步驟及關(guān)鍵注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-12-11 09:34:03
原代培養(yǎng)
小鼠腎小管上皮細(xì)胞（RTECs）的核心是無菌分離腎皮質(zhì)組織→酶解獲得腎小管片段/單細(xì)胞→純化去除間質(zhì)細(xì)胞→貼壁培養(yǎng)與擴(kuò)增，操作需嚴(yán)格遵循無菌原則，且要精準(zhǔn)控制酶解時(shí)間（避免細(xì)胞損傷）。以下是分階段的詳細(xì)操作步驟，附關(guān)鍵注意事項(xiàng)：
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備（核心：無菌 + 試劑預(yù)冷）
1、實(shí)驗(yàn)材料與試劑配制
類別 具體內(nèi)容
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6-8 周齡 SPF 級(jí)小鼠（C57BL/6 或 BALB/c，體重 20-25g，雌雄不限）
消化液 膠原酶 Ⅳ（1.5 mg/mL）+ 0.25% 胰酶 - EDTA，用無鈣鎂 PBS配制，0.22 μm 濾膜過濾除菌，4℃保存
完全培養(yǎng)基 DMEM/F12（1:1）+ 10% 胎牛血清（FBS，滅活）+ 1% 雙抗（青霉素 100 U/mL + 鏈霉素 100 μg/mL）+ 生長因子（EGF 10 ng/mL + 胰島素 5 μg/mL）
輔助試劑 無鈣鎂 PBS（預(yù)冷）、0.1% 明膠溶液（包被培養(yǎng)皿用）、臺(tái)盼藍(lán)染色液、200 目細(xì)胞篩
實(shí)驗(yàn)器材 眼科剪、眼科鑷、無菌培養(yǎng)皿（60 mm/100 mm）、離心管（15 mL/50 mL）、移液管，均需高壓滅菌
2、預(yù)處理操作
超凈臺(tái)紫外消毒 30 分鐘，通風(fēng) 10 分鐘；
0.1% 明膠溶液鋪在培養(yǎng)皿表面，37℃孵育 30 分鐘，吸棄多余明膠，晾干備用（促進(jìn)上皮細(xì)胞貼壁）；
消化液、完全培養(yǎng)基、預(yù)冷 PBS 提前放入 37℃水浴預(yù)熱。
二、腎皮質(zhì)組織分離（核心：去除髓質(zhì)和血管，減少雜質(zhì)）
小鼠處死后消毒：頸椎脫臼處死小鼠，75% 酒精浸泡全身 5 分鐘，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)內(nèi)的無菌培養(yǎng)皿中。
腎臟摘?。簾o菌操作打開腹腔，用眼科鑷輕輕拉出雙側(cè)腎臟，放入盛有預(yù)冷無鈣鎂 PBS 的培養(yǎng)皿中，沖洗 3 次，去除表面血跡和脂肪組織。
腎皮質(zhì)分離：
用眼科鑷捏住腎臟一端，眼科剪小心剪開腎包膜，剝離并丟棄包膜；
用剪刀切除腎髓質(zhì)（顏色較深的部分，腎小管主要集中在淺色的腎皮質(zhì)），僅保留腎皮質(zhì)組織；
將腎皮質(zhì)剪成 1 mm³ 左右的細(xì)小組織塊，用預(yù)冷 PBS 反復(fù)吹洗 3-4 次，靜置后棄上清，去除紅細(xì)胞和游離雜質(zhì)。
三、酶解消化（核心：避免過度消化，防止細(xì)胞破裂）
向組織塊中加入5 倍體積的預(yù)熱消化液，轉(zhuǎn)移至 15 mL 無菌離心管中。
37℃恒溫?fù)u床振蕩消化 30-40 分鐘，轉(zhuǎn)速控制在 100 rpm；每 10 分鐘輕輕顛倒離心管 1 次，顯微鏡下觀察組織塊分散情況（組織塊變松散、溶液略渾濁即可）。
加入等體積的完全培養(yǎng)基終止消化，用移液管輕輕吹打 10-15 次，使組織塊進(jìn)一步分散為細(xì)胞懸液。
細(xì)胞懸液通過200 目細(xì)胞篩過濾，去除未消化的組織碎片，收集濾液至新的 15 mL 離心管中。
四、細(xì)胞純化與接種（核心：差速貼壁去除成纖維細(xì)胞）
離心收集細(xì)胞：800 rpm、4℃離心 5 分鐘，棄上清；用預(yù)冷 PBS 重懸細(xì)胞沉淀，再次 800 rpm 離心 5 分鐘，洗去殘留酶液。
細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力檢測(cè)：用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)染色液 1:1 混合，計(jì)數(shù)活細(xì)胞（活細(xì)胞率需≥90%）。
差速貼壁純化：
按 1×10? cells/cm² 的密度，將細(xì)胞懸液接種到預(yù)包被明膠的培養(yǎng)皿中；
37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 小時(shí)，此時(shí)成纖維細(xì)胞會(huì)快速貼壁，而上皮細(xì)胞貼壁較慢；
輕輕吸棄培養(yǎng)基及未貼壁細(xì)胞，用預(yù)熱 PBS 沖洗培養(yǎng)皿 1 次，加入新鮮完全培養(yǎng)基。
五、培養(yǎng)與傳代（核心：控制融合度，維持上皮細(xì)胞表型）
1、原代培養(yǎng)
接種后 24 小時(shí)內(nèi)不移動(dòng)培養(yǎng)皿，讓上皮細(xì)胞充分貼壁；
48 小時(shí)后首次更換完全培養(yǎng)基，去除未貼壁的死細(xì)胞；
之后每 2-3 天更換 1 次培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)（原代 RTECs 呈多邊形/鵝卵石樣貼壁生長，鋪路石狀排列）。
2、傳代操作（細(xì)胞融合度達(dá) 80-90% 時(shí)進(jìn)行）
吸棄培養(yǎng)基，用預(yù)熱無鈣鎂 PBS 沖洗細(xì)胞表面 2 次，去除殘留血清；
加入適量 0.25% 胰酶 - EDTA，覆蓋細(xì)胞表面，37℃孵育 2-3 分鐘，顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、邊緣收縮時(shí)，立即加入完全培養(yǎng)基終止消化；
用移液管輕輕吹打細(xì)胞表面，使細(xì)胞脫落形成懸液，800 rpm 離心 5 分鐘，棄上清；
完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，按 1:2 的比例接種到新的明膠包被培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。
注意：原代 RTECs傳代不超過 5 代，超過 5 代后細(xì)胞易失去上皮極性，發(fā)生梭形化（間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化）。
六、關(guān)鍵質(zhì)量控制與注意事項(xiàng)
純度鑒定：培養(yǎng)至第 2 代時(shí)，通過免疫熒光檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志物（CK18/CK19），陽性率需≥90%；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（α-SMA）陰性，確保無成纖維細(xì)胞污染。
常見問題排查
貼壁率低：可能是酶解過度/不足，或培養(yǎng)皿未包被；優(yōu)化酶解時(shí)間至 30-35 分鐘，改用膠原 Ⅰ 型包被培養(yǎng)皿。
成纖維細(xì)胞污染：差速貼壁時(shí)間不足；延長首次貼壁時(shí)間至 2.5-3 小時(shí)，或加入成纖維細(xì)胞抑制劑。
細(xì)胞生長緩慢：培養(yǎng)基生長因子不足；補(bǔ)充 ITS（胰島素 - 轉(zhuǎn)鐵蛋白 - 硒）混合添加劑。
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