芽孢染色液的工作原理與使用方法及操作步驟與注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-05-19 09:07:42
百歐博偉生物：芽孢染色液的原理及使用方法基于芽孢的特殊結(jié)構(gòu)（如厚壁、低透性）及其與菌體對(duì)染料的親和力差異，通過(guò)加熱促進(jìn)染色劑滲透，結(jié)合復(fù)染實(shí)現(xiàn)區(qū)分。以下是綜合多個(gè)來(lái)源的詳細(xì)解析：
一、染色原理
1、芽孢結(jié)構(gòu)特性
芽孢是
芽孢桿菌屬和
梭菌屬形成的抗逆性休眠體，其壁厚、透性低，導(dǎo)致普通染色難以著色或脫色。因此需使用強(qiáng)著色力染料（如孔雀石綠、石碳酸復(fù)紅）并在加熱條件下染色。
2、染色機(jī)制
初染階段：加熱使芽孢壁透性增加，染料同時(shí)進(jìn)入菌體和芽孢。
脫色階段：水洗或酒精脫色時(shí)，菌體中的染料被洗脫，而芽孢內(nèi)染料因結(jié)構(gòu)致密保留。
復(fù)染階段：復(fù)染劑（如沙黃、番紅、堿性美藍(lán)）將菌體染成與芽孢對(duì)比鮮明的顏色。
3、關(guān)鍵因素
加熱：維持染液微沸（冒蒸汽但不沸騰），確保染料滲透芽孢，避免高溫破壞菌體結(jié)構(gòu)。
菌齡控制：選用培養(yǎng)24小時(shí)左右的菌種，過(guò)老或過(guò)幼均影響芽孢形成及染色效果。
二、染色方法
不同試劑盒或染色方案的步驟略有差異，以下為兩種常用方法：
方法1：孔雀石綠法（常規(guī)步驟）
1、涂片與固定
取菌液涂片，自然干燥后通過(guò)火焰快速固定3次。
2、初染與加熱
滴加孔雀石綠染液（A液）覆蓋涂片，用木夾夾持載玻片在酒精燈上加熱至染液冒蒸汽，維持4-5分鐘（或持續(xù)加熱6-8秒多次補(bǔ)充染液）。
3、脫色與復(fù)染
冷卻后水洗至無(wú)綠色脫出，滴加復(fù)染劑（如沙黃或番紅，B液）復(fù)染1-3分鐘，再次水洗干燥。
4、鏡檢結(jié)果
芽孢呈綠色，菌體呈紅色。
方法2：石碳酸復(fù)紅-美藍(lán)法
1、染色步驟
涂片后滴加石碳酸復(fù)紅液，加熱至蒸汽維持5分鐘，冷卻后脫色至無(wú)紅色流出。
復(fù)染堿性美藍(lán)2-3分鐘，水洗干燥。
2、鏡檢結(jié)果
芽孢呈紅色，菌體呈藍(lán)色。
三、注意事項(xiàng)
1、加熱控制
避免染液沸騰或蒸干，防止菌體破裂；若使用不加熱方案（如飽和孔雀綠液），需延長(zhǎng)染色時(shí)間至10分鐘。
2、菌種選擇
需確保菌體處于產(chǎn)孢階段，如
枯草芽孢桿菌培養(yǎng)24小時(shí)左右為宜。
3、脫色與復(fù)染
脫色需徹底，否則殘留初染劑影響復(fù)染效果；復(fù)染時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，避免遮蓋芽孢顏色。
4、安全防護(hù)
操作時(shí)佩戴手套和實(shí)驗(yàn)服，避免染料接觸皮膚。
四、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案
芽孢未著色：可能因加熱不足或菌齡不當(dāng)，需延長(zhǎng)加熱時(shí)間或更換菌種。
背景過(guò)深：脫色不徹底，可增加水洗次數(shù)。
區(qū)分死活芽孢：需使用萌發(fā)劑誘導(dǎo)萌發(fā)后鏡檢。
通過(guò)上述步驟與原理，可有效區(qū)分芽孢與菌體，適用于微生物學(xué)研究和臨床檢測(cè)。具體操作需根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)調(diào)整參數(shù)。
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