基礎(chǔ)分離液：Hanks平衡鹽溶液或磷酸鹽緩沖液，含Ca²?/Mg²?（維持細(xì)胞膜完整性）或無(wú)Ca²?/Mg²?（減少細(xì)胞聚集）。
組織獲?。?/div>
安樂(lè)死小鼠后迅速取材，置于預(yù)冷HBSS/PBS中。
剔除血管、脂肪等非目標(biāo)組織。
機(jī)械解離：
剪碎組織至1-3 mm³碎塊。
使用注射器活塞輕柔研磨或70 μm細(xì)胞篩過(guò)濾。
酶消化：
加入含酶的分離液（如0.1%膠原酶+0.01% DNaseⅠ），37℃振蕩消化10-30分鐘。
每10分鐘觀察一次，避免過(guò)度消化（導(dǎo)致細(xì)胞死亡）。
終止消化：
加入含血清的培養(yǎng)基中和酶活性。
離心（300×g，5分鐘）收集細(xì)胞，用PBS洗滌2-3次。
純化：
密度梯度離心分離特定細(xì)胞亞群。
磁珠分選（MACS）或流式分選（FACS）提高純度。
二、質(zhì)量控制關(guān)鍵指標(biāo)
1、細(xì)胞活性檢測(cè)
臺(tái)盼藍(lán)染色：活細(xì)胞拒染，死細(xì)胞呈藍(lán)色?；钚孕瑁?5%（理想＞90%）。
Calcein-AM/PI雙染：流式細(xì)胞術(shù)量化活/死細(xì)胞比例。
2、純度評(píng)估
流式細(xì)胞術(shù)：檢測(cè)特定表面標(biāo)志物。
免疫熒光/組化：驗(yàn)證目標(biāo)細(xì)胞特異性標(biāo)記。
3、無(wú)菌性檢測(cè)
微生物培養(yǎng)：取分離液接種于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，觀察渾濁度。
支原體檢測(cè)：PCR或Hoechst染色確認(rèn)無(wú)污染。
4、功能性驗(yàn)證
增殖能力：CCK-8或EdU染色檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。
特異性功能：如肝細(xì)胞白蛋白分泌、免疫細(xì)胞細(xì)胞因子釋放。
5、其他參數(shù)
滲透壓：270-310 mOsm/kg（與生理?xiàng)l件匹配）。
pH值：7.2-7.4（CO?培養(yǎng)箱中需調(diào)整）。
內(nèi)毒素檢測(cè)：LAL法檢測(cè)，要求＜0.1 EU/mL（尤其用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）。
三、常見(jiàn)問(wèn)題與優(yōu)化
1、低細(xì)胞活性：
縮短消化時(shí)間，預(yù)冷操作臺(tái)，優(yōu)化酶濃度。
避免反復(fù)離心，使用含BSA的緩沖液減少機(jī)械損傷。
2、雜質(zhì)過(guò)多：
增加過(guò)濾步驟（40 μm濾網(wǎng)），或梯度離心去除紅細(xì)胞/碎片。
3、微生物污染：
全程無(wú)菌操作，試劑過(guò)濾除菌（0.22 μm濾膜）。
4、細(xì)胞聚集：
加入DNaseⅠ（10-100 U/mL）或EDTA（0.5-2 mM）。
四、注意事項(xiàng)
批次記錄：記錄分離液配制時(shí)間、濃度、操作人員，確?？勺匪菪?。
個(gè)性化調(diào)整：不同組織（如脾臟、腫瘤、腦）需優(yōu)化酶組合及消化時(shí)間。
凍存保護(hù)：若需保存細(xì)胞，使用含10% DMSO的凍存液，逐步降溫至-80℃或液氮。
通過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制，可確保分離的小鼠細(xì)胞適用于下游實(shí)驗(yàn)（如原代培養(yǎng)、移植、分子機(jī)制研究），提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
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