常見(jiàn)問(wèn)題及對(duì)策
培養(yǎng)液PH值變化太快
可能原因
1. CO2 張力不對(duì) 。
2. 培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊 。
3. NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。
4. 培養(yǎng)液中鹽濃度不正確 。
5. 細(xì)菌、酵母或真菌污染 。
建議解決方法
1. 按培養(yǎng)液中NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3 對(duì)應(yīng)CO2 濃度為5％ 到10％。
2. 松開(kāi)瓶蓋1/4 圈。
3. 改用不依賴(lài)CO2 培養(yǎng)液。加HEPES 緩沖液至10 到25mM 終濃度。
4. 在CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。
5. 丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。
培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變
? 可能原因
1. 洗滌劑清洗后殘留有磷酸鹽，將培養(yǎng)基成分沉淀下來(lái) 。
2. 冰凍保存培養(yǎng)液。
? 建議解決方法
1. 用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后滅菌。
2. 將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動(dòng)使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。
培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀， 同時(shí)pH 發(fā)生變
? 可能原因
1. 細(xì)菌或真菌污染 。
? 建議解決方法
1. 丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌
培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁
? 可能原因
1.胰蛋白酶消化過(guò)度。
2.支原體污染。
3.培養(yǎng)瓶瓶底不干凈 。
4.培養(yǎng)液pH值過(guò)堿（NaHCO3分解）。
5.消化液或培養(yǎng)液配制錯(cuò)誤、過(guò)期儲(chǔ)存、儲(chǔ)存不當(dāng)。
6.細(xì)胞老化（如傳代前細(xì)胞已匯合導(dǎo)致失去貼附性）。
7.接種細(xì)胞起始濃度太低或太高 。
? 建議解決方法
1. 縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度。
2.分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
3.注意刷洗，或換用一次性塑料培養(yǎng)瓶 。
4.使用無(wú)菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無(wú)菌CO2（將培養(yǎng)液敞口放入培養(yǎng)箱也可）。
5.重新配置消化液或培養(yǎng)液 。
6.啟用新的保種細(xì)胞 。
7.調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度
懸浮細(xì)胞成簇
? 可能原因
1. 培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子 。
2. 支原體污染 。
3. 蛋白酶過(guò)度消化使得細(xì)胞裂解釋 。
4. DNA污染 。
? 建議解決方法
1. 用無(wú)鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕輕吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液。
2. 分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
3. 用DNase I 處理細(xì)胞。
原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染
? 可能原因
1. 原代培養(yǎng)組織在進(jìn)入培養(yǎng)前已污染。
? 建議解決方法
1. 培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織。
培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢
? 可能原因
1. 由于更換不同培養(yǎng)液或血清。
2. 培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子耗盡或缺乏或已被破壞。
3. 培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染。
4. 試劑保存不當(dāng) 。
5. 接種細(xì)胞起始濃度太低 。
6. 細(xì)胞已老化 。
7. 支原體污染。
? 建議解決方法
1. 比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。
2.換入新鮮配制培養(yǎng)液，或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長(zhǎng)因子。
3.用無(wú)抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物?；蛴每股爻?br />
4.血清需保存在-5℃ 到-20℃。培養(yǎng)液需在2~8℃避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2~8℃保存，并在2 周內(nèi)用完。
5.增加接種細(xì)胞起始濃度。
6.換用新的保種細(xì)胞。
7.分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
培養(yǎng)細(xì)胞死亡
? 可能原因
1. 培養(yǎng)箱內(nèi)無(wú)CO2 。
2. 培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大 。
3. 細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過(guò)程中損傷 培養(yǎng)液滲透壓不正確 。
4. 培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積 。
? 建議解決方法
1. 檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 。
2. 檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度 。
3. 取新的保存細(xì)胞種 。
4. 檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓。
注意：大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能耐受滲透壓為260 – 350mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。
5. 換入新鮮培養(yǎng)液 。
CO2 培養(yǎng)箱的水盤(pán)如何保持清潔？
?定期(至少每?jī)芍芤淮? 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。
為什么要熱滅活血清？
?加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。
L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？
L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有最終確定。L－谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。
GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？
GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，將其不穩(wěn)定的α－氨基用L－丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L－谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L－谷氨酰胺幾乎完全降解。
為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類(lèi)反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類(lèi)細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？
用無(wú)血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200－2000個(gè)/毫升，在0.1毫升的細(xì)胞中加入0.1毫升的0.4％的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色。
冷凍管應(yīng)如何解凍？
取出冷凍管后， 須立即放入37 ℃水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。
細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO？
除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO 敏感之細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。
可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無(wú)法存活。
可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類(lèi)？
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源， 所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。
何謂FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS 乃錯(cuò)誤的使用字眼，請(qǐng)不要再使用。CS(calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。
培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 % 或10% CO2？或根本沒(méi)有影響？
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 % CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí)，則應(yīng)使用5 % CO2培養(yǎng)細(xì)胞。
何時(shí)須更換培養(yǎng)基？
視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。
培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？
除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于-20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低，并可減少污染之機(jī)會(huì)。
懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時(shí)，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。
欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？
欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘，過(guò)高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。
細(xì)胞之接種密度為何？
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤(pán)之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。
細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？
動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO
(dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中， 必須使用前先行配制完成。
DMSO之等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾方式之為何？
冷凍保存使用之DMSO 等級(jí)， 必須為T(mén)issue culture grade之DMSO(如Sigma D2650)，其本身即為無(wú)菌狀況，第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于4°C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾DMSO，則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。
冷凍保存細(xì)胞之方法？
冷凍保存方法一:
冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20 ℃30 分鐘*) → -80 ℃16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二:
冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至-80 ℃ 以下，再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。-20 ℃不可超過(guò)1小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以5x106cells/ml vial 為宜。
應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？
細(xì)胞污染的種類(lèi)可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。
如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？
加入相應(yīng)抗生素或直接滅菌后丟棄之。
支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專(zhuān)家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無(wú)法以其外觀分辨之。
支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。
培養(yǎng)基的選擇？
培養(yǎng)某一類(lèi)型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)?？傊走xMEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI- 1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無(wú)血清培養(yǎng)的首選是AIM V培養(yǎng)基（SFM）。
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