孫凱1，魏霜2，劉玉莉2，許如蘇2，劉中勇2，鄞杰平2，袁俊杰3，吳希陽1*
1(暨南大學 理工學院, 食品科學與工程系，廣東 廣州，510632)2(汕頭出入境檢驗檢疫局，廣東 汕頭，515041)3(湛江出入境檢驗檢疫局，廣東 湛江，524000)
摘 要：根據已報道的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的23S rRNA基因保守序列，設計用于檢測植物乳桿菌的特異性DPO(dual priming oligonucleotide)引物，結合SYBR GreenⅠ實時熒光PCR技術，建立植物乳桿菌的DPO引物實時熒光PCR檢測方法，對其特異性和靈敏度進行了評價，并將建立的檢測方法用于實際樣品的檢測中。結果顯示，該方法對2株植物乳桿菌能得到陽性擴增，其余11株乳酸菌及陰性對照沒有擴增曲線，靈敏度高達0.001 ng/μL，而且在退火溫度為50～60 ℃范圍內不影響其特異性，表明該方法對退火溫度不敏感；用微生物菌制劑和酸奶共13種益生菌產品進行了驗證，檢出情況與產品標識一致。因此，該研究建立的SYBR GreenⅠ實時熒光PCR能夠快速、準確、高效地檢測微生物菌制劑及其他益生菌產品中的植物乳桿菌。
關鍵詞：植物乳桿菌；實時熒光PCR；DPO引物；檢測
植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)是一種廣泛使用的益生菌，具有維持腸道微生態(tài)平衡，提高機體免疫力等功效，目前已經被應用于食品、醫(yī)用益生菌制劑、微生物肥料等領域[1]。對這些產品中微生物的準確鑒定是產品質量控制的重要依據，因此建立一種快速、準確的鑒定方法具有重要意義。
目前乳桿菌屬的檢測主要依靠傳統(tǒng)生理生化和分子生物學方法進行。前者耗時耗力，而且由于乳桿菌屬許多種非常相似，生理生化特征也存在許多相似之處，實際檢測過程中難以判斷，不能滿足實際檢測的需要[2]?；谔禺愋砸锏腜CR的方法具備快速、準確、低成本的優(yōu)點，目前被廣泛用于轉基因、食源性微生物、醫(yī)學病原菌等方面的檢測[3-5]。目前PCR法已經被應用于植物乳桿菌的檢測，KWON等[6]建立用于檢測植物乳桿菌的普通PCR特異性引物；楊小紅等[7]建立了普通PCR法檢測植物乳桿菌，并用40株標準菌株驗證了方法的特異性，并將該特異性引物成功轉化成為農業(yè)部標準NY/T 2066—2011[8]。以往報道的特異性引物檢測植物乳桿菌全部使用的是普通引物，需要嚴格控制反應條件尤其是退火溫度，退火溫度的變化可能會影響到引物的特異性，例如農業(yè)部標準NY/T 2066—2011中所使用的植物乳桿菌特異性引物以較高的退火溫度(67℃)來保證引物的特異性。而不同實驗室之間由于儀器、人員等差異，可能會無法精確重復出試驗的各項條件，導致檢測特異性受到影響，可能造成誤判，而且普通PCR法需要進一步凝膠電泳判斷結果，增加了檢測時間。
DPO(dual priming oligonucleotide)引物是由CHUN等[9]于2007年第1次提出，其特點在于它包含2個各自獨立的特異性引物區(qū)域，5′端序列由18～25個堿基組成并與靶基因序列配對，3′端序列由6～12個堿基組成用來引導PCR反應的特異性延伸，這兩段獨立的特異性區(qū)域利用寡聚次黃嘌呤(Inosine，I)進行連接，由于次黃嘌呤比一般堿基的退火溫度低，在退火時寡聚次黃嘌呤形成類似泡狀的結構，從而使5′和3′區(qū)域形兩個獨立功能的雙特異性引物結構，而且由于其特殊的結構，引物自身以及引物之間很難形成二級結構且對退火溫度不敏感，在一定范圍內改變退火溫度對檢測特異性不產生影響，如圖1所示。而且理論上5′和3′任何一個區(qū)域超過3個堿基不匹配就不能擴增，運用DPO引物這一特點，已建立了基于DPO引物的SNP的檢測方法[9]。目前，DPO引物已經被廣泛應用于醫(yī)學病原菌、食源性微生物等[10-11]。本研究擬運用DPO引物高特異性、不受退火溫度影響等特征，結合SYBR Green Ⅰ實時熒光PCR技術，建立一種特異性強、靈敏度高的植物乳桿菌檢測方法。
Fig.1 Strategy and validation of DPO-based PCR
1 材料與方法
1.1 材料
供試材料：植物乳桿菌(ATCC 14917，ATCC 8014)、鼠李糖乳桿菌(ATCC 53103，ATCC 9595)、格氏乳桿菌(ATCC 33323)、約氏乳桿菌(ATCC 33200)、嗜酸乳桿菌(ATCC 314)、德氏乳桿菌(ATCC 4797)、發(fā)酵乳桿菌(ATCC 9338)、沙克乳桿菌(ATCC 15521)、詹氏乳桿菌(ATCC 25258)、副干酪乳桿菌(ATCC 25598)、干酪乳桿菌(ATCC 393)共13株乳桿菌，由暨南大學理工學院食品科學與工程系提供[12-13]。
試劑：細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；SYBR Premix Ex TaqTM購自寶生物工程(大連)有限公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。
儀器：LightCycle Roche 480熒光定量PCR儀，瑞士羅氏公司；VERITI 2.0 PCR擴增儀，美國AB公司； HE99電泳儀，美國GE公司；G:BOX EF凝膠成像系統(tǒng)，美國基因公司；ND-1000生物分光光度計，美國Therme公司。
1.2 基因組DNA的提取
菌株在MRS液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)24 h后，取1 mL菌液用于DNA的提取，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，參照說明書的要求操作，并用生物分光光度計測定DNA的濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?
1.3 引物的設計
參考DPO引物設計的要求[9]，用植物乳桿菌的23S rRNA基因序列(GenBank ID: AB092638.1)在NCBI上進行BLAST，根據比對結果在其保守區(qū)域設計DPO引物，上游引物LP-DPO-F：5′- GGGGCAACCCAGCAGTTTTAIIIIICTGTTACCAC -3′，下游引物LP-DPO-R：5′- TAATGAGATGTTTCAGTTCACAGCGIIIIICTCCAACTAG -3′，產物大小為91 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.4 實時熒光PCR反應體系及程序
實時熒光PCR反應體系為20 μL：10 μL SYBR Premix Ex Taq、引物終濃度為0.2 μmol/L、DNA模板50 ng、ddH2O補足至20 μL。反應程序：95 ℃ 預變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，在每個循環(huán)的72 ℃階段結束后收集熒光信號，在反應結束后進行熔融曲線的分析。
1.5 實時熒光PCR特異性試驗
按1.4實時熒光PCR反應體系及程序，對包括1.1所示的13株乳桿菌標準菌株進行SYBR GreenⅠ實時熒光PCR檢測。同時采用農業(yè)部標準NY/T 2066-2011[8]中植物乳桿菌的特異性引物PlantF/PlantR及反應條件對以上標準菌株進行特異性驗證。用無菌純水代替等量模板作為陰性對照。農業(yè)部標準引物序列為PlantF：5′- GTTGACTCGGTGGCGGCCTT -3′；PlantR：5′- GGAGCGCTTGTGACATCAGCCG -3′，產物大小為100 bp。
1.6 實時熒光PCR靈敏度試驗
利用植物乳桿菌ATCC 14917的DNA為模板，進行10倍梯度稀釋，得到濃度分別為10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001 ng/μL共稀釋6個梯度，每個梯度取1 μL做模板，進行實時熒光PCR靈敏度試驗。
1.7 不同退火溫度下特異性試驗
以1.1中13株乳桿菌標準菌株的基因組DNA為模板，運用本研究建立的方法，分別在50、55和60 ℃進行實時熒光PCR擴增，探討在不同退火溫度下DPO引物的特異性。
1.8 實際樣品的檢測
從市場采購13種益生菌制品，其中3種微生物菌制劑、10種酸奶，其產品標識菌種組成見表2。運用本研究建立的方法進行實際樣品的檢測，同時采用農業(yè)部標準方法進行對比。
2 結果與分析
2.1 基于DPO引物的實時熒光PCR的建立
用13株乳桿菌DNA作為模板用于建立基于DPO引物的植物乳桿菌的SYBR GreenⅠ實時熒光PCR檢測方法，結果如圖2所示。僅2株植物乳桿菌擴增生成“S”形的擴增曲線，結果為陽性，且熔解曲線測試為單一波峰，產物Tm值均一，為75 ℃，無非特異性產物出現(xiàn)；另外11株乳桿菌擴增無擴增曲線，結果為陰性。證明本研究設計的DPO引物特異性較好，建立的基于DPO引物的實時熒光PCR方法能夠準確對植物乳桿菌進行檢測。
A:基于DPO引物的實時熒光PCR特異性實驗結果；B: 基于DPO引物的實時熒光PCR熔解曲線1-13：植物乳桿菌(ATCC 14917)、植物乳桿菌(ATCC 8014)、鼠李糖乳桿菌(ATCC 53103)、鼠李糖乳桿菌(ATCC 9595)、格式乳桿菌(ATCC 33323)、約氏乳桿菌(ATCC 33200)、嗜酸乳桿菌(ATCC 314)、德氏乳桿菌(ATCC 4797)、發(fā)酵乳桿菌(ATCC 9338)、沙克乳桿菌(ATCC 15521)、詹氏乳桿菌(ATCC 25258)、副干酪乳桿菌(ATCC 25598)、干酪乳桿菌(ATCC 393)；14：陰性對照
圖2 基于DPO引物的實時熒光PCR方法的建立
Fig.2 Establishment of Real-time PCR on DPO primers method
2.2 靈敏度評價
利用建立的基于DPO引物的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法對含量分別為10、1、0.1、0.01、0.001和0.000 1 ng/μL的植物乳桿菌的DNA進行實時熒光PCR靈敏度檢測，結果如圖3，模板DNA起始濃度越高，Ct值越小，當DNA濃度稀釋到0.001 ng/μL時，取1 μL DNA做模板仍可以檢測到熒光信號的增加，Ct值為31，表現(xiàn)為陽性擴增；當DNA濃度稀釋到0.000 1 ng/μL時無擴增，檢測不到熒光信號的增加，故該方法對植物乳桿菌的DNA檢測靈敏度為0.001 ng/μL。10～0.001 ng/μL系列DNA模板的擴增產物的熔解曲線均呈現(xiàn)單一且相同的峰值，產物Tm值均一，為75 ℃，無非特異性產物出現(xiàn)。
A:基于DPO引物的實時熒光PCR靈敏度實驗結果；B: 基于DPO引物的實時熒光PCR熔解曲線1-6: DNA模板濃度依次為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL
圖3 基于DPO引物的實時熒光PCR的靈敏度檢測
Fig.3 Sensitivity test of real-time PCR on DPO primers
2.3 不同退火溫度下特異性對比
本研究還探討了退火溫度在50、55和60 ℃該檢測體系的特異性，結果如表1所示。
表1 DPO引物特異性
Table 1 The specificity of DPO
注：“+”表示陽性擴增；“-”表示陰性擴增。
在較低退火溫度(50 ℃)和較高的退火溫度下(60 ℃)下，利用本研究建立的方法僅植物乳桿菌(ATCC 14917、ATCC 8014)結果為陽性；其他11株乳桿菌均為陰性，檢測結果與農業(yè)部標準方法一致。說明本研究基于DPO引物建立的實時熒光PCR檢測方法對退火溫度不敏感，有利于在不同實驗室之間得到準確的檢測結果，適合該方法的推廣。
2.4 實際樣品的檢測
在3種微生物菌制劑產品中，1種微生物菌制劑產品檢測結果為陽性，另外2種檢測結果為陰性；在10中酸奶產品中，1種檢測結果為陽性，其余9種檢測結果為陰性。13株樣品的檢測結果與產品標識一致，結果如表2所示，且本研究的檢測方法無需凝膠電泳，與常規(guī)PCR相比大大節(jié)省了時間，農業(yè)部標準方法與本研究建立的方法檢測結果一致，證明本方法特異性強，檢測結果準確，實用性強，可運用于實際樣品的檢測。
表2 實際樣品的檢測
Table 2 The detection of samples from market
注：“+”表示陽性擴增；“-”表示陰性擴增。
3 討論與結論
植物乳桿菌作為益生菌被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、農業(yè)等領域，因此建立這些產品中植物乳桿菌的檢測方法具有重要意義。在細菌進化過程中，核糖體RNA(rRNA)基因的進化相對保守，因此被認為是對細菌進行親緣關系分析的最理想的基因，該基因序列幾乎可以對所有細菌進行屬水平的鑒定[14]。然而，由于16S rRNA基因的高度保守性，對相似性極高的近源種無法做出進一步區(qū)分，很難設計出種特異性引物[15]。23S rRNA基因與16S rRNA基因相比，23S rRNA的序列可變性更為明顯，可變區(qū)內多態(tài)性位點較多，不同細菌間差異相對較大，目前已經被廣泛應用于微生物鑒定中[16-17]。本研究針對植物乳桿菌的23S rRNA基因設計特異性DPO引物，建立了實時熒光PCR法，成功實現(xiàn)了種水平的鑒定。
特異性引物設計中，即要保證引物的特異性，又要保證引物的各個參數(shù)符合PCR反應的要求，因此在設計過程中存在一定的難度[18]。DPO引物作為一種新型的引物類型，其引物包含兩個各自獨立的特異性引物區(qū)域，5′端序列由18-25個堿基(Tm>65℃)組成并與靶基因序列配對，3′端序列包含6～12個堿基(GC含量40～80%)用來引導PCR反應的特異性延伸，這兩段獨立的特異性區(qū)域利用寡聚次黃嘌呤(Inosine, I)進行連接，在退火過程中寡聚次黃嘌呤會形成“泡狀”結構。MA等[10]的研究發(fā)現(xiàn)DPO引物中間的次黃嘌呤為3～8個時的效果較好，5個時效果最好。根據以上信息確定DPO引物的設計過程為：在基因序列保守區(qū)域確定3′端位置，向5′端延伸6-12個堿基保證3′端序列的GC含量在40～80%，緊接著再向5′端延伸5個次黃嘌呤形成寡聚次黃嘌呤結構，最后再向5′端延伸18-25個堿基保證5′端序列Tm大于65℃即可。這大大減少了特異性引物設計的難度，即能保證引物的特異性，又能保證引物能正常工作。
在實時熒光PCR中使用TaqMan探針能檢測PCR中的特異性擴增產物，而不受非特異性擴增產物的影響，因此被廣泛應用于微生物的定性及定量檢測[19]。但一條有效的探針需要具備很高的保守性、合適的GC含量和長度以及合適的Tm值等，而且不同乳桿菌之間的差異較小，這使特異性探針設計的難度大大增加。另外，探針合成的價格比較昂貴，因而在一定程度上限制了探針的使用。因此，本研究將SYBR GreenⅠ實時熒光PCR和DPO引物檢測技術相結合，吸收了DPO引物高特異性且引物之間難以形成二聚體等優(yōu)點，成功建立了植物乳桿菌的實時熒光PCR檢測方法。
DPO的另外一個優(yōu)勢在于它對退火溫度不敏感。本研究探討了在較低退火溫度(50 ℃)和較高的退火溫度下(60 ℃)下DPO引物的特異性，結果顯示與農業(yè)部標準方法一致，這大大增強了本方法在不同實驗室之間的通用性，徐義剛等[20-21]的研究也表明DPO引物不受退火溫度的影響，在較寬的退火溫度范圍內依然保持較高的特異性。另外，將DPO引物和SYBR Green I的實時熒光PCR結合起來，檢測結果易于判斷，無需凝膠電泳，這也增強了本方法的實用性。
本研究建立的檢測方法靈敏度高達0.001 ng/μL，這與武鑫[22]、謝志勤[23]、苗立中[24]等建立的SYBR GreenⅠ實時熒光PCR方法的靈敏度一致，這體現(xiàn)了該方法的高靈敏度。將該方法運用于13份實際樣品的檢測中，在2份標識中含有植物乳桿菌的樣品中準確檢出植物乳桿菌，其它樣品結果均為陰性，檢測結果與農業(yè)部標準方法一致，這體現(xiàn)了該方法的準確性。
本研究采用DPO引物和SYBR GreenⅠ實時熒光PCR技術相結合的方法，建立用于檢測植物乳桿菌的DPO引物實時熒光PCR方法。該方法特異性強，只有2株植物乳桿菌擴增結果為陽性，熔解曲線波峰單一，其余11株非植物乳桿菌擴增結果均為陰性；能檢測出0.001 ng/μL的DNA模板，靈敏度高；無需凝膠電泳，相比傳統(tǒng)PCR方法提高了檢測速度；對退火溫度不敏感，提高了不同實驗室之間的適用性；對13份樣品的檢測結果與農業(yè)部標準方法檢測結果一致，并與產品標識相符合。這表明本研究建立的DPO引物結合SYBR GreenⅠ實時熒光PCR技術的植物乳桿菌檢測方法具有速度快、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，適用于酸奶、微生物菌制劑等產品的檢測中。
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Real-time PCR for the detection of Lactobacillusplantarumbased on dual priming oligonucleotide system
SUN Kai1, WEI Shuang2, LIU Yu-li2, XU Ru-su2, LIU Zhong-yong2,YIN Jie-ping2,YUAN Jun-jie3, WU Xi-yang1*
1 (Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China)2 (Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shantou 515041, China)3 (Zhanjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhanjiang 524000, China)
ABSTRACT：The species-specific DPO (dual priming oligonucleotide) primers were designed basing on the 23S rRNA gene sequences ofLactobacillus plantarum. A SYBR GreenⅠreal-time PCR assay based on DPO primers was developed for the detection of L. plantarum. The specificity and sensitivity of the assay have been estimated. The results showed that this method was of high specificity at annealing temperature range from 50 to 60 ℃, and only two L. plantarum strains could be amplified. The other 10 Lactobacillus. spp. strains gave negative results, and the sensitivity of this method reached 0.001 ng/μL. The specificity and sensitivity of the assay was evaluated using 13 probiotics products including microbiological preparation and yogurt, and the results were in consistent with the product identification. Therefore, L. plantarum can be detected rapidly, accurately and efficiently by this method.
Key wordsLactobacillus plantarum; real-time PCR; DPO (dual priming oligonucleotide); detection
DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609031
第一作者：碩士研究生(吳希陽教授為通訊作者,E-mail:tkentwu@jnu.edu.cn)。
基金項目：國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局科技計劃項目(2015IK078)
中國微生物查詢網（family998.com）轉載于食品與發(fā)酵工業(yè)雜志2016年9期