一、背景
小鼠胰腺Β細胞含SV40大T抗原，適用于轉染，源于10周雌性小鼠。
二、小鼠胰腺Β細胞培養(yǎng)操作
1)復蘇小鼠胰腺Β細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)小鼠胰腺Β細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)小鼠胰腺Β細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數。
b、根據細胞數量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應用
小鼠胰腺Β細胞可以用于Exendin-4對氧化應激誘導小鼠胰腺β細胞凋亡的保護作用及其機制研究：
探討NF-κB-iNOS-NO信號通路在第三丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)誘導小鼠胰腺β細胞株MIN6細胞凋亡中的作用;在此基礎上,進一步研究GLP-1受體激動劑Exendin-4對t-BHP誘導的MIN6細胞凋亡的作用及其可能的機制。
方法：選用小鼠β細胞株MIN6細胞為研究對象,用t-BHP誘導刺激,模擬體外β細胞氧化應激損傷后的細胞凋亡模型,通過MTT觀察t-BHP作用后細胞的存活率;AO-EB染色熒光顯微鏡觀測細胞凋亡形態(tài),Annexin-Ⅴ-PI染色流式細胞技術測定細胞凋亡率,Griess化學顯色法檢測氧化損傷過程中細胞內一氧化氮(NO)水平,同時應用Western blot技術檢測胞漿誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)蛋白、胞漿及胞核核因子-κB片斷p65(NF-κB p65)蛋白表達水平的變化。
在此基礎上,分別應用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)、iNOS抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯(NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester,L-NAME)預處理并檢測上述指標,以明確NF-κB-iNOS-NO信號通路在t-BHP誘導MIN6細胞凋亡中的作用;隨后用不同濃度(10,100 nmol/L)的Exendin-4預處理,觀察Exendin-4對t-BHP誘導MIN6細胞凋亡的保護作用,并進一步研究Exendin-4能否通過NF-κB-iNOS-NO通路影響t-BHP誘導MIN6細胞發(fā)生凋亡性損傷。
結果：MTT顯示tBHP(12.5200μmol/L)作用不同時間后可明顯抑制MIN6細胞的生長,并呈現一定的時效和量效關系;AO-EB熒光顯微鏡及Annexin-Ⅴ-PI雙染流式細胞檢測證實25μmol/L濃度的tBHP處理60min后,誘導β細胞的損傷作用以凋亡為主,而更高濃度的tBHP使細胞由凋亡轉向壞死。25μmol/L tBHP處理60min后同時引起細胞NO水平明顯升高;該濃度的tBHP處理30min時胞漿iNOS蛋白達高峰水平;而該濃度的tBHP作用20min時胞核NF-κB活化片斷p65蛋白達高峰水平;iNOS抑制劑L-NAME(500μmol/L)或抗氧化劑NAC(10mmol/L)預處理均可明顯抑制tBHP誘導的β細胞凋亡及NO水平的增高。不同濃度的Exendin-4預處理預處理18h同樣抑制tBHP誘導的β細胞凋亡及NO水平的增高,并呈現一定的劑量依賴性,并且Exendin-4能抑制tBHP誘導的β細胞胞核NF-κB p65及胞漿iNOS蛋白的表達水平。
結論：
(1)t-BHP可誘導胰島β細胞發(fā)生凋亡性損傷,在此過程中伴隨細胞內NO水平的增加;
(2)氧化應激-NF-κB-iNOS-NO-凋亡通路可能是t-BHP誘導胰島β細胞凋亡的重要通路之一;
(3)GLP-1受體激動劑Exendin-4可以劑量依賴性地抑制t-BHP誘導胰島β細胞的凋亡,同時抑制細胞NO水平;
(4)Exendin-4可能通過抑制細胞內NF-κB活化、胞漿iNOS表達水平來抑制NO水平,最終減輕氧化應激損傷誘導的β細胞凋亡。Exendin-4在胰腺β細胞保護治療中具有潛在的應用價值。
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