百歐博偉生物：除了對環(huán)境（即空氣、純化水和設備表面）中的微生物進行檢測和計數外，更重要的是對有代表性的環(huán)境微生物分離物進行鑒定，以檢測變化的趨勢。環(huán)境中微生物類型的明顯變化可能表明偏離了環(huán)境正常控制水平。有幾種鑒定方法可用于鑒定環(huán)境中的微生物菌株。
鑒定方法的類型
為了鑒定環(huán)境中的微生物分離株，通常使用以下鑒定方法：
為了進行分離株的推定鑒定，可以使用以下推定方法，例如選擇性/差異瓊脂（即Vogel-Johnson瓊脂，MacConkey瓊脂，Cetrimide瓊脂）上的顏色反應，革蘭氏染色結果（例如，陽性或陰性以及形態(tài)——球菌、桿菌、酵母）和診斷測試（即，過氧化氫酶，凝固酶，溶葡萄球菌酶、桿菌肽、細胞色素氧化酶、氧化/發(fā)酵（O/F）試驗）。
為了對分離物進行表型鑒定，通常使用以下方法：生化鑒定試劑盒和MALDI-TOF質譜。在生化鑒定試劑盒中使用碳利用和生化反應來鑒定屬/種水平。MALDI-TOF質譜法生成分離物的蛋白質組指紋圖譜，以完成屬/種水平的鑒定。
對于細菌的鑒定，最常見的系統(tǒng)發(fā)育方法是16S rRNA測序。對于真菌的鑒定，最常見的系統(tǒng)發(fā)育方法是真菌內部轉錄間隔區(qū)（ITS2）和LSU-D2 rDNA測序。
1、革蘭氏染色
對環(huán)境細菌分離物的第一個鑒定步驟是根據菌落形態(tài)特征（如顏色、形狀、高度、表面和邊緣），將代表性分離物培養(yǎng)到無菌的大豆酪蛋白消化瓊脂培養(yǎng)基（SCDAM）上進行革蘭氏染色。然而，需要注意的是，使用R2A瓊脂或平板計數瓊脂回收的來自水的分離菌可能需要在低營養(yǎng)瓊脂上繼代培養(yǎng)，以獲得足夠的生長，因為它們受到營養(yǎng)壓力，可能無法在高營養(yǎng)培養(yǎng)基（如SCDAM）上生長。18至24小時分離物用于確定革蘭氏反應和菌落形態(tài)（例如，桿菌、球菌或酵母）。如果使用16S rRNA測序或MALDI-TOF鑒定屬/種水平的分離物，則無需進行細菌革蘭氏染色。如果過度熱固定、過度脫色或使用培養(yǎng)時間超過24小時會獲得不正確的革蘭氏染色結果，很可能使用不正確的生化鑒定試劑盒，導致不正確的鑒定。
2、非芽孢革蘭氏陽性桿菌
放線菌屬(Actinomyces)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、丹毒絲菌屬（Erysipelothrix）、李斯特菌屬（Listeria）、Cutibacterium和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）是非芽孢革蘭氏陽性桿菌，可在環(huán)境樣本中分離。放線菌可以從其他非孢子形成的革蘭氏陽性桿菌中區(qū)分出來，因為革蘭氏染色劑在顯微鏡下會顯示一個分支的菌絲網絡。此外，放線菌種類可以與瓊脂表面上的其他細菌菌落區(qū)分開來，因為它們往往非常密集和堅韌。為了推定區(qū)分棒狀桿菌、Cutibacterium、丹毒絲菌、李斯特菌和乳酸桿菌，可以進行以下生化測試：過氧化氫酶、硫化氫和運動性。棒狀桿菌屬、Cutibacterium和李斯特菌屬為過氧化氫酶陽性，而乳桿菌和丹毒絲菌屬為過氧化氫酶陰性。在TSI瓊脂上，丹毒絲菌屬呈陽性，乳桿菌屬呈陰性。棒狀桿菌和Cutibacterium是非能動的，而李斯特菌屬僅在室溫下是能動的（翻滾運動）。利用假定的生化反應將Cutibacterium與其他非芽孢革蘭氏陽性桿菌分離是非常困難的。通過使用生化鑒定試劑盒、16S rRNA測序或MALDI-TOF分析，可以在物種水平上鑒定革蘭氏陽性桿菌菌株。
3、革蘭氏陽性球菌
放線菌在環(huán)境樣本中分離革蘭氏陽性球菌很常見。過氧化氫酶試驗可用于將革蘭氏陽性球菌分為兩組：過氧化氫酶陽性[葡萄球菌（Staphylococcus）、微球菌（Micrococcus）或考克氏菌（Kocuria）和過氧化氫酶陰性（腸球菌（Enterococcus）、鏈球菌（Streptococcus）或氣球菌（Aerococcus）]。為了將葡萄球菌從微球菌和考克氏菌中區(qū)分出來，可以使用溶葡萄球菌酶或桿菌肽敏感性試驗。在溶葡萄球菌酶敏感性試驗中，葡萄球菌屬敏感，而微球菌屬和考克氏菌耐受。在桿菌肽敏感性試驗中，葡萄球菌屬具有耐受性，而微球菌和考克氏菌具有敏感性。用常規(guī)的生化方法很難區(qū)分考克氏菌和微球菌。因此，這些微生物通常被稱為微球菌/考克氏菌。表型鑒定方法無法識別考克氏菌屬中的所有成員，因為生物化學和碳同化試驗的結果在考克氏菌屬的不同物種中顯示出異質性。大多數生物化學數據庫并不包括所有分類的考克氏菌屬物種。目前，考克氏菌屬物種的鑒定通常采用16S rRNA測序和MALDI-TOF。凝固酶試驗用作推定試驗，以確定葡萄球菌分離物是否為金黃色葡萄球菌。然而，現在有七種公認的凝固酶陽性葡萄球菌：Staphylococcusaureus, S.intermedius, S.schleiferi subsp. coagulans, S. hyicus, S. lutrae, S. delphini, 和S. pseudintermedius。此外，現在還發(fā)現了凝固酶陰性的金黃色葡萄球菌分離株。不能假設所有凝固酶陽性的革蘭氏陽性球菌分離株都是金黃色葡萄球菌，而所有凝固酶陰性的革蘭氏陽性球菌分離株都不是金黃色葡萄球菌。建議使用生化鑒定試劑盒、16S rRNA測序或MALDI-TOF將所有的葡萄球菌分離物鑒定到物種水平，而不是使用凝固酶試驗。
在環(huán)境樣本中分離出過氧化氫酶陰性的革蘭氏陽性球菌是罕見的，但也可能發(fā)生。過氧化氫酶陰性的革蘭氏陽性球菌可分離為氣球菌、腸球菌和鏈球菌。由于氣球菌類似于血液瓊脂平板上的α-溶血性鏈球菌，因此很難通過推定鑒定，而且僅通過生化檢測也很難進行鑒定。推定的生化測試，如視黃素、桿菌肽、6.5% NaCl中的生長、膽汁七葉皂苷水解和馬尿酸水解，可用于分離腸球菌和鏈球菌。為了在屬/種水平上鑒定氣球菌，建議使用16S rRNA測序或MALDI-TOF。對于腸球菌和鏈球菌，使用生化鑒定試劑盒、16S rRNA測序或MALDI-TOF。
4、革蘭陰性桿菌
革蘭氏陰性桿菌可在環(huán)境樣品中分離。對于推定的生化測試，氧化酶測試用于確認細胞色素C氧化酶的存在，以區(qū)分氧化酶陽性（ox+）和氧化酶陰性（ox-）群的革蘭氏陰性桿菌。推定氧化-發(fā)酵（O/F）試驗可用于確定革蘭氏陰性桿菌是否能通過發(fā)酵或有氧呼吸（氧化）代謝葡萄糖，從而將氧化酶陽性革蘭氏陰性桿菌分離為氧化菌[即假單胞菌(Pseudomonas)、伯克霍爾德菌（Burkholderia）、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)和棲稻黃色單胞菌(Flavimonas oryzihabitans)]，發(fā)酵菌[弧菌(Vibrio)、氣單胞菌(Aeromonas)、發(fā)光桿菌（Photobacterium）和鄰單胞菌屬(Plesiomonas)]和陰性菌[產堿菌（Alcaligenes）和莫拉氏菌屬(Moraxella)]以及氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌分為氧化菌[即不動桿菌屬（Acinetobacter）、淺黃色假單胞菌(Pseudomonas luteola)和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stentrophomonas maltophilia)和發(fā)酵菌（腸桿菌科）]。根據這兩項生化推定試驗的結果，可使用適當的生化鑒定試劑盒確定屬/種水平的分離物鑒定。此外，16S rRNA測序或MALDI-TOF分析也可用于鑒定屬/種水平的菌株。
5、霉菌分離物
在環(huán)境樣品中分離到霉菌是很常見的。表型和系統(tǒng)發(fā)育鑒定方法可用于從物種水平上鑒定霉菌分離物。霉菌的表型鑒定方法如下：宏觀和微觀特征（傳統(tǒng)形態(tài)學方法）、Biolog FF MicroPlateTM和MALDI-TOF。傳統(tǒng)的形態(tài)學方法基于分離物的宏觀（群體）特征和微觀特征，用于確定屬/種的鑒定。關鍵的宏觀特征包括顏色、紋理、反向顏色的使用以及可擴散顏料的存在。關鍵的微觀特征包括菌株的菌絲類型、孢子類型和生殖結構。傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法在鑒定霉菌時通常缺乏特異性，并且可能耗時。根據形態(tài)結構，在屬/種水平上鑒定霉菌是主觀的。Biolog FF MicroPlateTM利用基質氧化產生的顯色（四氮唑還原）和真菌生長產生的濁度，提供一種特征反應模式或指紋，用于從物種水平識別霉菌。MALDI-TOF生成霉菌的蛋白質組指紋，用于確定霉菌分離物的物種水平鑒定。但是，MALDI-TOF的商業(yè)數據庫仍需要改進，因為數據庫覆蓋率不足。一些研究機構使用內部數據庫作為補充。
對于霉菌的系統(tǒng)發(fā)育鑒定方法，有兩種不同的方法：對大亞基核糖體DNA(D2 LSU）的D2區(qū)域進行rDNA測序，以及對一個或兩個內部轉錄間隔區(qū)（ITS）進行測序。ITS2比D2擴增片段DNA序列具有更多的變異性，因此提供了更高的特異性，也為真菌鑒定提供了更高的分辨率。在無法使用D2 LSU序列獲得物種級鑒定的情況下，通?？梢允褂肐TS測序獲得物種級鑒定。一般來說，ITS序列之間的分化程度更高。在某些情況下，單獨的D2 LSU測序無法區(qū)分不同但密切相關的屬，或者無法區(qū)分更大范圍的密切相關屬，ITS測序卻可以成功地進行物種級鑒定。
6、酵母分離物
酵母通常存在于環(huán)境樣本中，革蘭氏染色呈陽性。生化鑒定試劑盒和MALDI-TOF分析等表型方法可用于在屬/種水平上鑒定酵母菌株。推定生化試驗可用于將酵母分離物鑒定為白色念珠菌：選擇性/差異性瓊脂，例如鉍葡萄糖甘氨酸酵母(BIGGY)瓊脂、各種顯色瓊脂，以及用于檢測以下兩種酶的存在的快速生化試驗：L-脯氨酸氨基肽酶和?-半乳糖苷酶。大亞基(LSU)D2區(qū)和ITS2區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育rDNA測序也可用于確定酵母分離物屬/種水平的鑒定。
7、幾個特例
（1）放線菌屬、棒桿菌屬和Cutibacterium。環(huán)境中分離菌，如放線菌屬（Actinomyces）、棒桿菌屬（Corynebacterium）和Cutibacterium，很難進行革蘭氏染色，因為它們的細胞壁在細胞分裂過程中對破裂敏感，導致它們在革蘭氏陽性的同時染色革蘭氏陰性，結果是革蘭氏可變反應。為確認革蘭氏可變微生物的革蘭氏染色結果，建議進行KOH試驗。
（2）芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬。芽孢桿菌和類芽孢桿菌屬是內生孢子形成的革蘭氏陽性桿菌，是常見的環(huán)境分離菌。一般來說，由于難以使用生物化學或系統(tǒng)發(fā)育鑒定方法區(qū)分該屬的某些成員，芽孢桿菌物種無法鑒定到屬/種水平。例如，很難基于生物化學方法區(qū)分出蠟樣芽孢桿菌群的單個成員。此外，基于系統(tǒng)發(fā)育方法也很難解決蠟樣芽孢桿菌群的鑒定問題。炭疽桿菌、蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的16S rRNA基因序列具有高度的序列相似性（>99%）。在16S rDNA序列上，炭疽桿菌和蠟樣芽胞桿菌的某些菌株只有一個核苷酸不同，也有報道稱炭疽桿菌的序列與蠟樣芽孢桿菌的序列相同。
很難從生化水平上將芽孢桿菌和類桿菌物種彼此分離?？赡鼙仨毷褂?6SrDNA基因型和表型鑒定方法的組合來將分離物鑒定為擬桿菌物種。
8、結論
有許多不同的方法可用于從屬/種水平上鑒定回收的環(huán)境微生物分離物，但測序方法（16S rDNA，ITS，全基因組測序）無疑可以提供最精準的鑒定結果。
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