一、背景
細菌總RNA快速抽提試劑盒可從細菌細胞中快速提取總RNA，可同時處理大量不同樣品。因為細菌RNA半衰期很短，RNA很容易發(fā)生降解。針對這一難題，本試劑盒采用溶菌酶與裂解液Buffer Rlysis-B共同作用，快速裂解樣品，再通過氯仿抽提、無水乙醇沉淀等步驟，可獲得濃度高、完整性好的RNA。
適合于從各種來源的細菌（革蘭氏陽性或陰性菌等）培養(yǎng)液中快速提取RNA。使用本試劑盒，從1 ml對數(shù)生長期的細菌菌液中提取5~15μg總RNA。提取的總RNA純度高，沒有蛋白和其他雜質(zhì)的污染，可直接用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern blot、Dot blot、polyA篩選、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆等多種下游實驗。
二、操作步驟
1、取1 ml對數(shù)生長期的細菌，8,000 rpm 4°C離心1 min，徹底棄掉培養(yǎng)基，加100μl溶菌酶，振蕩混勻。
2、立即加入900μl Buffer Rlysis-B震蕩混勻，室溫放置3 min。
3、向裂解樣品中加入200μl氯仿，充分混勻。12,000 rpm 4°C離心5 min，取上清。
4、向上清液中加入1/3體積無水乙醇，混勻，室溫放置3 min，12,000 rpm 4°C離心5 min，小心倒掉上清。
5、用700μl的75%乙醇（請用DEPC-treated ddH2O配制）洗滌沉淀，12,000 rpm 4°C離心3 min,小心倒掉上清。
6、重復步驟5一次。
7、室溫倒置10 min，盡可能使離心管中殘留的乙醇徹底揮發(fā)。加入30-50μl的DEPC-treated ddH2O溶解沉淀，立即使用或-70°C長期保存。
三、應用
用于嗜鹽四聯(lián)球菌總RNA提取方法的優(yōu)化研究：
以嗜鹽四聯(lián)球菌為實驗材料，大腸桿菌（Escherichiacoli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為對照菌，采用改良前后的Trizol法，RNAisoplus法、Qiagen試劑盒法以及Triton X-100法分別提取上述3株菌的總RNA。
用瓊脂糖凝膠電泳和核酸測定儀檢測總RNA的提取質(zhì)量，通過反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcriptionPCR，RT-PCR）及實時熒光定量PCR（Real Time quantitative PCR，RT-qPCR）對嗜鹽四聯(lián)球菌的總RNA提取質(zhì)量進行評估，分析各種細菌總RNA提取方法的優(yōu)劣，以確定嗜鹽四聯(lián)球菌總RNA的最優(yōu)提取方法。
利用總RNA的最優(yōu)提取方法（Triton X-100法），提取嗜鹽四聯(lián)球菌總RNA，通過RT-qPCR分析不同鹽濃度脅迫條件對嗜鹽四聯(lián)球菌分子伴侶蛋白DnaK mRNA的轉(zhuǎn)錄水平影響。
建立了適宜嗜鹽四聯(lián)球菌總RNA提取的最優(yōu)方法，為革蘭氏陽性菌總RNA的提取提供重要的理論依據(jù)和實驗基礎；初步探索了DnaK在嗜鹽四聯(lián)球菌抗逆系統(tǒng)中的作用。
研究成果如下：
（1）改良后的RNAiso plus法和Trizol法，通過加熱更徹底的裂解細菌細胞，并且使得獲得的RNA不含有16S和23S rRNA。有效地改善了嗜鹽四聯(lián)球菌的RNA質(zhì)量。
（2）利用無水乙醇替代75%乙醇，可更有效地去除RNA溶液中的鹽離子，降低RNA樣品中的雜質(zhì)污染，排除鹽離子對后續(xù)酶反應的抑制作用。
（3）本研究證明，Triton X-100法尤其適合嗜鹽四聯(lián)球菌等難破壁革蘭氏陽性菌的總RNA提取，并具有快速、經(jīng)濟、高效等優(yōu)點。此法能有效保持RNA的完整性，同時可去除16S和23S rRNA，為某些對16S和23S rRNA敏感的酶反應提供高質(zhì)量RNA模板。
（4）利用RT-qPCR檢測在鹽脅迫下DnaK基因的表達水平，結(jié)果表明，該基因在鹽脅迫下的表達有所提高，說明DnaK基因在嗜鹽四聯(lián)球菌對抗鹽脅迫等逆境中具有重要的作用。
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