進(jìn)入無菌室前，要如何對培養(yǎng)基與試劑進(jìn)行無菌處理？
小楊 / 2026-01-06 09:28:20
百歐博偉生物：進(jìn)入無菌室前，培養(yǎng)基與試劑的無菌處理需遵循“按材質(zhì)/成分適配滅菌方式 + 驗(yàn)證滅菌效果 + 無菌保存”的核心邏輯，避免因滅菌不徹底導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)污染。以下是針對不同類型培養(yǎng)基與試劑的標(biāo)準(zhǔn)化處理方案，涵蓋操作細(xì)節(jié)、參數(shù)設(shè)置、注意事項(xiàng)，完全適配微生物培養(yǎng)、細(xì)胞操作等實(shí)驗(yàn)場景：
一、核心原則
適配性原則：根據(jù)培養(yǎng)基/試劑的耐熱性、成分穩(wěn)定性選擇滅菌方式（耐高溫→高壓蒸汽滅菌；熱敏→過濾滅菌；易揮發(fā)→特殊消毒）；
徹底性原則：滅菌參數(shù)（溫度、壓力、時間）需達(dá)標(biāo)，避免“半生滅菌”；
防二次污染原則：滅菌后需密封保存，冷卻、轉(zhuǎn)移過程中避免接觸非無菌環(huán)境。
二、培養(yǎng)基的無菌處理（按狀態(tài)/成分分類）
培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基（如 LB 培養(yǎng)基、DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液）和固體培養(yǎng)基（如 LB 平板、瓊脂斜面），處理方式需結(jié)合是否含熱敏成分（如血清、抗生素、酶）區(qū)分：
1、不含熱敏成分的培養(yǎng)基（耐高溫，優(yōu)先高壓蒸汽滅菌）
適用于：普通微生物培養(yǎng)基（LB、營養(yǎng)肉湯）、基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不含血清/抗生素）、無菌水、瓊脂培養(yǎng)基（未凝固前）。
操作步驟（以 121℃高壓蒸汽滅菌為例）：
步驟 操作細(xì)節(jié) 關(guān)鍵參數(shù)/注意事項(xiàng)
配制與分裝 按配方準(zhǔn)確稱量試劑，用去離子水溶解，調(diào)節(jié) pH 至所需范圍 固體培養(yǎng)基需先溶解瓊脂，加熱時不斷攪拌，防止糊底；分裝后立即加蓋透氣塞，避免滅菌后污染
滅菌前檢查 檢查高壓滅菌鍋水位（需淹沒加熱管），將分裝后的培養(yǎng)基放入滅菌籃，避免堆疊（確保蒸汽流通） 禁止將密封過緊的容器放入，否則可能爆炸
高壓滅菌操作 關(guān)閉滅菌鍋門，排氣至壓力為 0；設(shè)置參數(shù)：121℃、103.4kPa（1.05kg/cm²），保持 20-30 分鐘（固體培養(yǎng)基需 30 分鐘，液體培養(yǎng)基 20 分鐘） 冷空氣未排盡會導(dǎo)致滅菌溫度不足
滅菌后處理 滅菌結(jié)束后，自然降壓至 0，緩慢打開排氣閥；取出培養(yǎng)基，冷卻至 50-60℃（固體培養(yǎng)基）時倒平板/制斜面，液體培養(yǎng)基冷卻至室溫后密封保存 倒平板時需在超凈工作臺內(nèi)操作，避免空氣微生物污染；培養(yǎng)基冷卻后若出現(xiàn)渾濁、沉淀，需丟棄
2、含熱敏成分的培養(yǎng)基（不耐高溫，需過濾滅菌 + 無菌添加）
適用于：細(xì)胞培養(yǎng)液（如 DMEM + 血清）、微生物選擇性培養(yǎng)基（含抗生素、酶制劑）、血清、胰酶等。
操作流程（分兩步：基礎(chǔ)培養(yǎng)基滅菌 + 熱敏成分無菌添加）：
基礎(chǔ)培養(yǎng)基高壓滅菌：將不含熱敏成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基按上述高壓蒸汽滅菌流程處理（121℃、20 分鐘），冷卻至室溫備用；
熱敏成分過濾滅菌（核心步驟，需在超凈工作臺內(nèi)操作）：
步驟 操作細(xì)節(jié) 關(guān)鍵注意事項(xiàng)
濾器準(zhǔn)備 選擇 0.22μm 無菌濾膜，將濾器、接收瓶（無菌三角瓶）組裝好，用牛皮紙包裹瓶口 濾器需提前檢查完整性（無破損、漏液），組裝時戴無菌手套，避免手接觸濾膜和接收瓶內(nèi)壁
平衡與過濾 將熱敏成分從 4℃冷藏取出，平衡至室溫；用無菌移液管將溶液注入濾器，打開真空泵，緩慢過濾（流速不宜過快，避免濾膜破裂） 抗生素溶液濃度需準(zhǔn)確，過濾前需用少量無菌水沖洗濾器（潤洗濾膜，避免殘留污染）
無菌添加 過濾后的熱敏成分立即加入冷卻至室溫的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，輕輕顛倒混勻（避免劇烈搖晃產(chǎn)生氣泡） 添加比例需精準(zhǔn)，混合后立即密封，4℃冷藏（短期使用）或 - 20℃冷凍（長期保存）
?? 關(guān)鍵提醒：含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基需現(xiàn)配現(xiàn)用，或分裝后冷凍保存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致成分失效。
三、試劑的無菌處理（按類型分類）
試劑按性質(zhì)可分為緩沖液、鹽溶液、酶制劑、抗生素、染料等，處理方式需結(jié)合其穩(wěn)定性和使用場景：
1、耐高溫試劑（高壓蒸汽滅菌）
適用于：PBS 緩沖液、生理鹽水、緩沖液（pH 穩(wěn)定）、各種鹽溶液。
操作要點(diǎn)：
配制后調(diào)節(jié) pH 至所需值，分裝至無菌瓶中，加蓋透氣塞；
滅菌參數(shù)：121℃、103.4kPa，20 分鐘（若試劑含葡萄糖等易碳化成分，可降至 115℃、68.9kPa，30 分鐘）；
滅菌后冷卻至室溫，密封保存（4℃可存放 1-2 個月），使用前檢查是否渾濁、有沉淀。
2、熱敏試劑（過濾滅菌）
適用于：酶制劑、抗生素、血清、細(xì)胞因子、某些染料（如熒光染料）。
操作細(xì)節(jié)：
酶制劑需在冰浴上解凍，過濾時避免高溫（全程在 4℃或冰浴環(huán)境），過濾后立即分裝至無菌離心管，-20℃或 - 80℃冷凍保存；
抗生素溶液通常配制成 100-1000 倍母液，過濾滅菌后分裝，避免反復(fù)凍融（可按單次用量分裝）；
熒光染料需避光過濾（用棕色濾器或包裹黑布），滅菌后密封避光保存。
3、易揮發(fā)/腐蝕性試劑（化學(xué)消毒 + 無菌處理）
適用于：酒精（75%）、甲醛、含氯消毒劑。
處理方式：
75% 酒精：直接購買無菌包裝，或用無水乙醇和無菌水按比例配制后，0.22μm 濾膜過濾滅菌（避免高溫導(dǎo)致酒精揮發(fā)）；
含氯消毒劑：按比例稀釋后，密封保存，使用前搖晃均勻（無需滅菌，高濃度消毒劑本身具有殺菌作用）；
甲醛：用于無菌室熏蒸消毒，無需單獨(dú)滅菌，使用時按比例稀釋，熏蒸后需通風(fēng) 24 小時以上。
4、固體試劑（滅菌后溶解）
適用于：抗生素粉末、酶粉、培養(yǎng)基干粉。
操作要點(diǎn)：
固體試劑需在無菌環(huán)境下（超凈工作臺）稱量，用無菌水或無菌緩沖液溶解后，按熱敏試劑處理（0.22μm 過濾滅菌）；
稱量時使用無菌藥匙，避免交叉污染，溶解后立即密封，按要求溫度保存。
四、滅菌效果驗(yàn)證（關(guān)鍵步驟，避免實(shí)驗(yàn)失?。?/strong>
所有培養(yǎng)基與試劑滅菌后需進(jìn)行效果驗(yàn)證，確保無微生物污染：
1、無菌試驗(yàn)（必做）
液體培養(yǎng)基/試劑：取少量樣品（約 1mL）接種至無菌培養(yǎng)皿，或直接放入無菌試管，37℃培養(yǎng) 24-48 小時（微生物培養(yǎng)）或 5% CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 小時（細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)），觀察是否有菌落生長或渾濁；
固體培養(yǎng)基：倒平板后，不接種任何樣品，37℃培養(yǎng) 24-48 小時，觀察平板表面是否有雜菌菌落。
2、物理/化學(xué)指示驗(yàn)證
物理指示：高壓滅菌時放入溫度壓力記錄儀，確認(rèn)滅菌過程中溫度、壓力達(dá)到設(shè)定參數(shù)；
化學(xué)指示：在培養(yǎng)基/試劑包裝內(nèi)放入滅菌指示卡（如蒸汽滅菌指示卡、輻照滅菌標(biāo)簽），滅菌后觀察指示卡是否變色（如蒸汽滅菌指示卡由白色變?yōu)楹谏?/div>
3、生物指示劑驗(yàn)證（定期做，批量滅菌時）
使用生物指示劑（如
嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子、
枯草芽孢桿菌孢子），與培養(yǎng)基/試劑同時滅菌，滅菌后將指示劑接種至培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 48 小時，若指示劑未生長，說明滅菌徹底。
五、禁忌與注意事項(xiàng)
禁止將熱敏成分直接高壓滅菌，否則會導(dǎo)致成分變性失效；
過濾滅菌時，濾膜需選擇合適孔徑（0.22μm 可截留細(xì)菌，0.1μm 可截留支原體），細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑建議使用 0.1μm 濾膜；
滅菌后的培養(yǎng)基/試劑需密封保存，瓶口用纏繞（避免透氣塞受潮污染），液體試劑避免倒置存放；
若培養(yǎng)基滅菌后出現(xiàn)渾濁、沉淀、顏色異常，或無菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雜菌生長，需立即丟棄，不得使用；
批量滅菌時，需做好記錄（滅菌日期、時間、參數(shù)、操作者），便于追溯；
無菌處理后的培養(yǎng)基/試劑需在有效期內(nèi)使用（液體培養(yǎng)基 4℃保存不超過 1 個月，冷凍保存不超過 3 個月；抗生素母液 - 20℃保存不超過 6 個月）。
六、總結(jié)
培養(yǎng)基與試劑的無菌處理核心是“選對滅菌方式 + 嚴(yán)控參數(shù) + 驗(yàn)證效果”：耐高溫的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、緩沖液優(yōu)先高壓蒸汽滅菌；熱敏的血清、酶、抗生素必須過濾滅菌；易揮發(fā)試劑需化學(xué)消毒或過濾滅菌。全程需避免二次污染，滅菌后通過無菌試驗(yàn)、指示卡驗(yàn)證確保無雜菌，才能進(jìn)入無菌室使用。實(shí)際操作中需結(jié)合試劑性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
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