總大腸菌群酶底物法的核心原理與操作流程及質(zhì)控要點！
小楊 / 2026-01-05 10:03:39
百歐博偉生物：總大腸菌群酶底物法是基于總大腸菌群產(chǎn)生的 β- 半乳糖苷酶水解色原底物產(chǎn)生顏色變化，通過多管法或定量盤法計數(shù)陽性反應(yīng)并查 MPN 表定量的快速檢測技術(shù)，核心標(biāo)準(zhǔn)為 HJ 1001-2018 與 GB/T 5750.12-2023，適用于地表水、地下水、生活飲用水、污水等，24h 可出結(jié)果，結(jié)果以 MPN/100mL 表示。以下從原理、流程、質(zhì)控等方面詳細(xì)說明：
一、核心原理
總大腸菌群在 36.5℃±0.5℃培養(yǎng) 24h±2h 條件下可產(chǎn)生 β-D - 半乳糖苷酶，該酶能水解培養(yǎng)基中無色的鄰硝基苯 -β-D - 吡喃半乳糖苷（ONPG），生成黃色的鄰硝基苯酚，以此判定陽性反應(yīng)；若同時檢測
大腸埃希氏菌，可通過其產(chǎn)生的 β- 葡萄糖醛酸酶水解熒光底物 MUG 產(chǎn)生熒光輔助判斷。
二、關(guān)鍵試劑與儀器
試劑：酶底物試劑（含 ONPG、選擇性抑菌劑等）、無菌水、硫代硫酸鈉（除氯）、EDTA 二鈉（除重金屬）、陽性對照菌（如
大腸埃希氏菌）、陰性對照菌（如
假單胞菌）。
儀器：無菌采樣容器、定量盤（51 孔/97 孔）或試管、封口器、恒溫培養(yǎng)箱（36.5℃±0.5℃）、紫外燈（可選，用于大腸埃希氏菌熒光檢測）。
標(biāo)準(zhǔn)操作流程（以 HJ 1001-2018 為例）
樣品采集與保存：用無菌容器采集 100mL 水樣，含氯樣品加硫代硫酸鈉，含重金屬樣品加 EDTA 二鈉，0-4℃冷藏，6h 內(nèi)分析，最長不超過 24h。
樣品制備：水樣搖勻，無需稀釋或按污染程度梯度稀釋，確保陽性孔數(shù)在有效計數(shù)范圍。
三、接種與培養(yǎng)
多管法：取不同稀釋度水樣加入無菌試管，每管加酶底物試劑，封口后 36.5℃±0.5℃培養(yǎng) 24h±2h。
定量盤法：將 100mL 水樣與酶底物試劑混勻，倒入 51 孔/97 孔定量盤，封口后同溫同時間培養(yǎng)。
結(jié)果觀察與計數(shù)：培養(yǎng)后，試管/定量盤孔內(nèi)呈黃色為總大腸菌群陽性，統(tǒng)計陽性數(shù)，查對應(yīng) MPN 表得 MPN/100mL，全陰性則報告未檢出。
結(jié)果報告：按標(biāo)準(zhǔn)保留有效數(shù)字，≥100MPN/100mL 用科學(xué)計數(shù)法，注明方法與檢出限。
四、質(zhì)量控制要點
質(zhì)控環(huán)節(jié) 具體措施
空白對照 每批實驗設(shè)無菌水空白，確保無陽性，排除污染
陽性對照 用大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)株做陽性對照，保證試劑與培養(yǎng)有效
陰性對照 用假單胞菌等非目標(biāo)菌做陰性對照，驗證抑菌特異性
平行樣 每批樣品做 10% 平行樣，相對偏差需符合標(biāo)準(zhǔn)要求
計數(shù)質(zhì)控 嚴(yán)格按定量盤/多管對應(yīng)的 MPN 表查值，避免誤判顏色
五、干擾與消除
余氯：采樣時加硫代硫酸鈉還原，消除酶抑制。
重金屬：加 EDTA 二鈉絡(luò)合，降低細(xì)胞毒性。
高濁度/有色水樣：適當(dāng)稀釋后檢測，避免影響顏色判讀。
雜菌干擾：酶底物試劑含抑菌劑，可抑制多數(shù)異養(yǎng)菌，減少假陽性。
六、方法優(yōu)勢與局限
優(yōu)勢：無需配制培養(yǎng)基，操作快，24h 出結(jié)果，特異性強，適配多場景檢測。
局限：高色度/高濁度水樣需稀釋，依賴顏色判讀，需嚴(yán)格質(zhì)控避免污染與誤判。
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