卡他莫拉菌(moraxellacatarrhalis ,MC)為革蘭陰性雙球菌, 原屬奈瑟菌屬(Neisseria catarrhalis ,NC), Catlin 在1970 年將此菌分類為布蘭漢菌屬(Branhamellacatarrhalis , BC), 1984 年在伯杰分類細(xì)菌學(xué)手冊中被列為莫拉菌屬的布蘭漢亞屬(subgenus branhamella)。MC 是人類上呼吸道的常居菌種, 為條件致病菌。該菌可引起人類的多種感染, 可累及全身。國外資料顯示,MC 在成人下呼吸道感染及兒童肺炎、中耳炎等標(biāo)本中的分離率, 僅次于流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌列第三位。因此, 快速鑒定MC具有重要的臨床意義。我們用3-乙酰吲哚紙片法檢測乙酰酯酶, 快速鑒定MC。并測定4 種β內(nèi)酰胺抗生素的復(fù)方制劑及亞胺培南/西司他丁對β 內(nèi)酰胺酶陽性MC 的抗菌活性。報(bào)告如下。
材料和方法
一、材料
1. 菌株來源: MC (228 株)、淋病奈瑟菌(15株)、腦膜炎奈瑟菌(3株)、奈瑟菌屬(153 株)、莫拉菌亞屬(24 株)、博德特菌屬(6 株)、不動桿菌屬(138株)均為臨床分離株。標(biāo)準(zhǔn)菌株MC 9602 , 9707 , 0101為全國臨床檢驗(yàn)中心質(zhì)控菌株,MC 的ATCC 25238 、解乳糖奈瑟菌ATCC 23970 、淡黃色奈瑟菌ATCC14799 、腦膜炎奈瑟菌ATCC13102 、金黃色葡萄球菌ATCC 25923 ,29213 為本實(shí)驗(yàn)室菌庫保存。
2. 培養(yǎng)基: 5 %羊血瓊脂培養(yǎng)基(SBA), 5 %兔血巧克力瓊脂培養(yǎng)基(RChoc), 5 %羊血巧克力瓊脂培養(yǎng)基(SChoc), 含50 μg/ml 萬古霉素的兔血巧克力瓊脂培養(yǎng)基(Choc-V), 淋病奈瑟菌培養(yǎng)基(NGA), MH培養(yǎng)基(MHA), 5 %羊血MH 培養(yǎng)基(MHB), 腦心瓊脂培養(yǎng)基(BCA), 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NUA), 中國藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(ZLA),DNA 瓊脂培養(yǎng)基均為本室自制。
3. 試劑: 蛋白胨、DNA 瓊脂粉、MH 瓊脂粉、VITEK-(NHI 和GNI)鑒定試卡購自生物梅里埃公司。萬古霉素為美國禮來公司產(chǎn)品, 鹽酸四甲基對苯二胺、3-乙酰吲哚購自SIGMA 公司,Nitrocefin 購自O(shè)XOID 公司(英國)。氧化酶紙片(1 %鹽酸四甲基對苯二胺溶液浸泡紙片后吹干備用), 乙酰酯酶紙片(100 mg/ml 3-乙酰吲哚丙酮溶液浸泡50 片紙片后吹干備用), Nitrocefin 紙片(12.5 μg/片Nitrocefin吹干備用)。
4. 抗生素: 哌拉西林(PIPC), 齊魯制藥廠產(chǎn)品; 氨芐西林(AMP), 華北制藥有限公司產(chǎn)品;哌拉西林/舒巴坦(PIPC/SBT)(4∶1), 海口杰威藥物研究所有限公司產(chǎn)品;哌拉西林/他唑巴坦(PIPC/TAZ)(8:1),美國立達(dá)公司產(chǎn)品;氨芐西林/舒巴坦(AMP/SBT)(2∶1), 頭孢哌酮/舒巴坦(CFP/SBT)(1∶1), 美國輝瑞公司產(chǎn)品;亞胺培南/西司他丁(IPM/CST)(1∶1), 美國默沙東藥廠產(chǎn)品。
二、方法
1. 菌株分離與鑒定: 將可疑標(biāo)本接種于SBA 和Choc-V 瓊脂平板上, 置5 %CO2 孵箱, 35 ℃培養(yǎng)24 ～72 h 觀察結(jié)果。細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定按文獻(xiàn)進(jìn)行, 分離到的菌株經(jīng)涂片革蘭染色鏡檢、觸酶、氧化酶試驗(yàn)后, 用VITEK-(NHI 和GNI)鑒定試卡鑒定到種。
2. 氧化酶試驗(yàn): 按文獻(xiàn)[ 5] 進(jìn)行。
3. DNA 酶試驗(yàn): 按文獻(xiàn)[ 5] 進(jìn)行。
4. 乙酰酯酶試驗(yàn):用無菌生理鹽水將3-乙酰吲哚紙片沾濕, 取待檢菌落涂在紙片上, 3 min 內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)綠色為陽性反應(yīng)。以MC 的ATCC 25238 , 全國臨床檢驗(yàn)中心質(zhì)控菌株9602 , 9707 , 0101 作為陽性對照。
5. 生長指數(shù)(GI)測定: 取經(jīng)Rchoc 平板24 h 培養(yǎng)的卡他莫拉菌ATCC 25238 菌落于2 ml 無菌鹽水中, 制成0.5 麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙? 再用無菌鹽水進(jìn)行1 :10 連續(xù)稀釋, 取10-5 、10-6 、10-7稀釋度菌液100 μl分別接種在9 種培養(yǎng)基上(Rchoc 、Schoc 、Choc-V 、SBA 、MHA 、MHB 、BCA 、NUA 、ZLA), 分別置普通孵箱和5 %CO2 孵箱各1 套, 于35 ℃孵育24 、48 、72 、96 h ,計(jì)數(shù)少于10 個(gè)菌落平板上的菌落數(shù), 并用游標(biāo)卡尺量出菌落直徑, 求其均值(mm), 再乘以此最高稀釋度的對數(shù)即得GI。
6. β 內(nèi)酰胺酶試驗(yàn): 用無菌蒸餾水將Nitrocefin紙片沾濕, 取MC 菌落涂在紙片上, 5 min 內(nèi)紙片變紅色者判為β 內(nèi)酰胺酶陽性。7 .藥敏試驗(yàn):根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會1998 年版標(biāo)準(zhǔn), 采用瓊脂平皿二倍稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC),用多點(diǎn)接種儀定量種菌。以金黃色葡萄球菌ATCC 29213 為質(zhì)控菌株監(jiān)測整個(gè)試驗(yàn)過程, 質(zhì)控值超出范圍者, 該批試驗(yàn)數(shù)據(jù)作廢, 找出原因后重復(fù)試驗(yàn)。
結(jié)果
1. 氧化酶試驗(yàn): 228 株MC 、15 株淋病奈瑟菌、3株腦膜炎奈瑟菌、153 株奈瑟菌、24 株莫拉菌、6 株博德特菌氧化酶均為陽性, 138 株不動桿菌氧化酶為陰性。
2. DNA 酶試驗(yàn): 228 株MC 中DNA 酶全為陽性, 15 株淋病奈瑟菌、3 株腦膜炎奈瑟菌、153 株奈瑟菌、24 株莫拉菌、6 株博德特菌、138 株不動桿菌中DNA 酶均為陰性?？ㄋ鷮NA 酶的敏感性為100 %, 特異性為100 %。
3. 乙酰酯酶試驗(yàn): 15 株淋病奈瑟菌、3 株腦膜炎奈瑟菌、153 株奈瑟菌、24 株莫拉菌亞屬、6 株博德特菌乙酰酯酶均為陰性, 138 株不動桿菌中乙酰酯酶陽性114 株(占82.6 %), 228 株卡他莫拉菌乙酰酯酶全為陽性?？ㄋ鷮σ阴ｕッ傅拿舾行詾?00 %, 特異性為75.7 %。但與近緣菌(淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、奈瑟菌屬、莫拉菌亞屬)比較特異性為100 %。
4. β內(nèi)酰胺酶: 2 28 株MC 中β 內(nèi)酰胺酶陽性212株, 24株莫拉菌亞屬β內(nèi)酰胺酶陽性5株, 15株淋病奈瑟菌、3 株腦膜炎奈瑟菌、153 株奈瑟菌、6 株博德特菌β 內(nèi)酰胺酶均為陰性。
5. 不同培養(yǎng)基上的GI 值比較: MC 的ATCC 25238 在ZLA 培養(yǎng)基上不生長;在MHA 、BCA 、NUA 3種培養(yǎng)基上生長不良, 分別經(jīng)24 , 48 , 72 , 96 h 培養(yǎng), 與Rchoc 瓊脂培養(yǎng)基的GI 值比較, 差異有顯著性(P<0.05);MC 的ATCC 25238 在Rchoc 、Schoc 、Choc-V 、SBA 、MHB 5 種培養(yǎng)基上經(jīng)24 , 48 , 72 , 96 h 培養(yǎng)的GI 值結(jié)果比較, 差異無明顯意義(P>0.05);5 %CO2環(huán)境與空氣環(huán)境比較, 對GI 值結(jié)果影響不明顯(P >0.05)。結(jié)果如表1 所示。
6. 藥敏試驗(yàn): 如表2 所示, PIPC 、AMP 、PIPC/SBT 、CFP/SBT 、PIPC/TAZ 、AMP/SBT 、IPM/CST 對卡他莫拉菌的MIC50 和MIC90 分別為0.5 , 4.0 , 0.06 ,0.5 , 0.06 , 0.125 , 2.0 , 2.0μg/ml 和2.0 , 8.0 , 0.25 ,1.0 , 0.25 , 2.0 μg/ml ; PIPC/SBT和PIPC/TAZ的MIC50和MIC90分別較單PIPC 降低了8 倍;AMP/SBTR 的MIC50和MIC90較單AMP 降低了32 倍和4 倍。
討論
MC 與許多嚴(yán)重感染性疾病有關(guān), 但由該菌引起的感染發(fā)病率一直難以估計(jì)。因?yàn)?MC 生長較緩慢, 在不含血的培養(yǎng)基(營養(yǎng)瓊脂、MH 瓊脂、腦心瓊脂)上生長不良, 菌落及菌體形態(tài)與許多近緣菌相似, 分離及鑒定較為困難。為此, 提高M(jìn)C 分離率已成為臨床診斷和治療MC 感染所急需。國外已建立起多種檢測MC 的方法, 如丁酸酯酶法、MUB 法、CONFIRM 法及血清學(xué)檢測法等。國內(nèi)多采用DNA 酶及硝酸鹽還原試驗(yàn)將MC 與近緣菌相區(qū)別, 方法既繁瑣又費(fèi)時(shí), 結(jié)果也不易判斷。我們采用3-乙酰吲哚紙片法檢測MC 產(chǎn)生的乙酰酯酶快速鑒定MC , 此法操作簡便, 易于判斷, 敏感性為100 %, 和近緣菌(淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、奈瑟菌屬、莫拉菌亞屬)比較特異性為100 %, 與DNA 酶試驗(yàn)及生化鑒定結(jié)果的相關(guān)性比較均為100 %。雖然不動桿菌的乙酰酯酶陽性率高達(dá)82.6 %, 但是不動桿菌的氧化酶陰性, DNA 酶試驗(yàn)陰性, 在普通瓊脂及中國藍(lán)瓊脂上生長良好, 且菌落較MC 濕潤和光滑, 稍加注意不難區(qū)別。用3-乙酰吲哚紙片法檢測MC 產(chǎn)生的乙酰酯酶, 3 min 即可出結(jié)果, 成本較低, 一片紙片可鑒定多個(gè)菌落, 可用于可疑菌落的篩選, 是臨床實(shí)驗(yàn)室快速鑒定MC 的良好方法, 值得推廣應(yīng)用。
在9 種臨床實(shí)驗(yàn)室常用的瓊脂培養(yǎng)基上比較MC 的生長情況, 試驗(yàn)結(jié)果表明,MC 對營養(yǎng)要求較高, 在不含血的MH 培養(yǎng)基、腦心瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和中國藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上生長不良或不生長。在5 種含血的培養(yǎng)基上MC 的GI 比較結(jié)果顯示,MC 在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上比在血瓊脂培養(yǎng)基上生長較好, GI 值比較差異無顯著性(P >0.05);MC 在不同血源巧克力瓊脂培養(yǎng)基上的生長狀況比較, 兔血稍好于及羊血(P >0.05)。為提高M(jìn)C 的分離率, 我們采用含50 μg/ml 萬古霉素的兔血巧克力瓊脂培養(yǎng)基(加入萬古霉素可抑制革蘭陽性細(xì)菌的生長, 增加了對MC 的選擇性)及5 %CO2 條件下對MC 進(jìn)行分離培養(yǎng), 并將培養(yǎng)時(shí)間延長到72 h , 分離率大有提高。
對228 株MC 的β 內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果分析表明,其陽性率高達(dá)93.0 %, 應(yīng)引起臨床醫(yī)生的重視。哌拉西林/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦及亞胺培南/西司他丁對β內(nèi)酰胺酶陽性MC 有很好的抗菌活性。在MC 感染的治療中, 應(yīng)選用含β 內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)方制劑或用對β 內(nèi)酰胺酶頭孢菌素進(jìn)行治療。MC 的近緣菌(淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、奈瑟菌屬、莫拉菌亞屬等)中, β 內(nèi)酰胺酶的陽性率非常低, 因此, β 內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)也可作為MC 與近緣菌的輔助試驗(yàn)。
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