百歐博偉生物教您如何成功復(fù)蘇動物細胞！
百歐博偉生物 / 2019-05-25 10:43:19
有經(jīng)驗或剛剛從事細胞培育作業(yè)的人員都應(yīng)該認真仔細地詢問下細胞提供方提供的建議，提早了解所要培育細胞的詳細資料，準備好細胞所要用到的培育基和相關(guān)試劑，盡管所有的貼壁、半貼壁或許懸浮細胞處理方式差不多，但是不同的實驗室培育條件和處理力度還有試劑的批間差這些問題存在，也會導(dǎo)致對細胞處理不當，或許環(huán)境的不適應(yīng)而形成細胞的死亡。
一、????收到細胞的注意事項
一般從細胞庫購買的細胞通常保存在凍存管中用干冰運輸，或是在培養(yǎng)瓶中常溫運輸。在收到凍存細胞后，很重要的一點是迅速解凍使其立即復(fù)蘇并除去DMSO，然后將它們放置到培養(yǎng)基中。如果做不到上面這點，需將細胞存儲在液氮中（-130℃以下）。不要將凍存細胞儲存在高于-130℃的溫度下，這會使細胞存活率迅速下降。
二、了解細胞特性
在細胞培養(yǎng)之前，我們要了解一下你所要養(yǎng)細胞的基本特性，這點可以從細胞的產(chǎn)品說明書或者從ATCC細胞庫查詢。除此之外我們還要知道每管細胞的數(shù)量，建議分裂或傳代的比例，和已知細胞的傳代代次等信息。
三、準備培養(yǎng)基
復(fù)蘇細胞時需要準備合適的培養(yǎng)基，血清和細胞生長所需的添加劑。大部分培養(yǎng)細胞所用的培養(yǎng)體系，可以在訂購細胞系時獲得。
雖然大多數(shù)細胞系可以在不止一種培養(yǎng)基中生長，但是當培養(yǎng)基改變時，細胞的性質(zhì)也會變化。因此，使用細胞庫推薦的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞會獲得最好的效果。
四、開啟凍存管
1.準備一個培養(yǎng)瓶，加入適宜細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，液體體積按照說明書的推薦配置，并平衡培養(yǎng)基的溫度和pH（CO2）?！ ?br />
2.在37℃水浴中或細胞的正常生長溫度下將凍存管輕輕搖動。解凍要快，約2分鐘或直到冰晶融化即可。
3.從水浴中取出凍存管并用浸泡或噴灑70%乙醇的方式來消毒。進一步的操作均需在無菌操作臺中嚴格無菌條件下進行。
4.擰開凍存管的管帽并將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到一個含有9 ml推薦培養(yǎng)基的無菌離心管中。通過溫和離心（125×g 10 min）除去冷凍保護劑（DMSO）。棄去上清，并用1或2 ml完全培養(yǎng)基重懸細胞。將這些細胞懸液轉(zhuǎn)移到含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中并輕輕搖動以徹底混勻。
5.培養(yǎng)24小時后檢查細胞狀態(tài)并在需要時進行傳代。
注：某些細胞系，如雜交瘤細胞，需要幾天的時間才能從凍存狀態(tài)完全復(fù)蘇。某些雜交瘤細胞在培養(yǎng)的第一天活力較差，并會產(chǎn)生細胞碎片。在此之后，細胞就會開始復(fù)蘇，并進入指數(shù)增長。
五、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)
某些細胞，是在培養(yǎng)瓶中以活細胞的形式運輸?shù)?。這些培養(yǎng)瓶中會接種細胞，孵育并保證細胞能生長，然后補充滿培養(yǎng)基后再運輸。
在收到培養(yǎng)瓶后，目視檢查培養(yǎng)基是否污染。包括異常的pH變化（苯酚紅變?yōu)辄S色或紫色），渾濁度，或有無顆粒。在低倍率（100×）的倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)基中是否有微生物污染以及細胞的形態(tài)。
如果細胞是單層貼壁生長：
1.無菌操作，取出大約5至10ml的運輸培養(yǎng)基。運輸培養(yǎng)基可以保存在4℃?zhèn)溆谩?br />
2.將培養(yǎng)瓶放在產(chǎn)品說明書中推薦的溫度和CO2濃度下培養(yǎng)（大多數(shù)細胞系為37℃與5%CO2）直到細胞可以傳代培養(yǎng)。
如果細胞不貼壁或是懸浮狀態(tài)生長：
1.在無菌條件下，將培養(yǎng)瓶的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到離心管中。
2.在125×g轉(zhuǎn)速下離心5～10 min。
3.取出大約10 ml運輸培養(yǎng)基的上清液，并重懸細胞。將取出的運輸培養(yǎng)基儲存在4℃?zhèn)溆谩?br />
4.無菌條件下，轉(zhuǎn)移懸浮細胞到25 cm2或75 cm2的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶大小取決于細胞株。
5.按照產(chǎn)品說明書中推薦的溫度和CO2濃度培養(yǎng)細胞，直到細胞可以傳代培養(yǎng)。
原代細胞來源于一塊碎的或酶消化的組織。原代培養(yǎng)物，是多種類型細胞的混合物，保留了其來源組織的特點。一段時間后，原代培養(yǎng)的細胞會達到融合狀態(tài)，即在培養(yǎng)瓶中的所有可用空間由于細胞擴增都被覆蓋。在此之后，細胞需要消化（通常用蛋白水解酶，如胰蛋白酶）為單個細胞并且傳代（分裂，傳代或轉(zhuǎn)移）。在第一次傳代以后，培養(yǎng)物通常被稱為一個細胞系。每一次傳代培養(yǎng)，細胞群體由于快速生長的細胞占主導(dǎo)地位而變得更均勻。具有所需特性的細胞也可以通過克隆，從培養(yǎng)物中選出。
二倍體細胞很少可以倍增超過幾代。它們只有有限的復(fù)制能力，并且在細胞倍增20至80次后開始減緩并最終停止分裂。最近的證據(jù)表明，某些細胞中觀察到的細胞衰老與預(yù)計的復(fù)制性衰老不同，可能是由于不適當?shù)呐囵B(yǎng)條件導(dǎo)致的。還有其他數(shù)據(jù)顯示，對某些物種的細胞系（尤其是人源的）即使生長在改進的培養(yǎng)條件下仍存在復(fù)制衰老。這種衰老是由細胞分裂時染色體末端（端粒）縮短調(diào)控的。
相反，傳代（或永生化）細胞具有無限增殖能力。這些細胞系通過多種手段中的其中一種來使細胞永生化或轉(zhuǎn)化。許多傳代細胞來自腫瘤組織。一般細胞庫收集的大部分細胞系是傳代的，只有少數(shù)是有限傳代的。
正如以上提到的，細胞系要么在培養(yǎng)瓶表面貼壁生長（錨定依賴性）要么懸浮生長（非錨定依賴性）。細胞的生長和分裂，通常遵循一個由四個階段組成的特征性增長模式：停滯期，對數(shù)期（指數(shù)期），平穩(wěn)期（平臺期）和衰退期。
停滯期——將細胞接種至培養(yǎng)瓶之后，細胞逐步恢復(fù)的同時，緩慢生長。
對數(shù)期（指數(shù)期）——細胞進入一個對數(shù)生長的時期，一直持續(xù)到整個生長表面被占滿或細胞密度超過培養(yǎng)基提供營養(yǎng)的能力。
平穩(wěn)期——細胞增殖減慢或停止。
衰退期——如果不更換培養(yǎng)基且細胞數(shù)量不減少，細胞活力會下降，并出現(xiàn)細胞死亡。
為了確?；盍?，遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定，必須使細胞保持在對數(shù)期。這意味著細胞需要在進入平穩(wěn)增長階段之前，或在單層細胞長成100%融合之前，或在懸浮細胞達到推薦的最大細胞密度之前定期進行傳代培養(yǎng)。為每個細胞系繪制生長曲線，對于測定該細胞系的生長特性是必要的。
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