小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法！
小佳 / 2019-05-14 14:20:06
一、分離方法
1、斷頸法處死懷孕12～13天的CF-1小鼠，浸入75％的酒精中消毒。
2、將小鼠放在超凈臺無菌的解剖盤中，打開腹腔，找出子宮，用剪刀將左右兩側(cè)的子宮在輸卵管與子宮角的銜接處剪下，小心剪下子宮的聯(lián)體部分，置于無菌的60mm培養(yǎng)皿中。
3、將子宮置于15ml離心管中，用10ml PBS洗3遍。
4、用尖鑷子撕開子宮壁和胎膜，取出胎鼠，放在新的培養(yǎng)皿中。
5、用PBS將胎鼠洗3遍。
6、用滅菌的眼科剪去除胎鼠的胚囊，釋放胚胎，并胚胎計數(shù)。
7、將胚胎移到干凈的培養(yǎng)皿中，PBS洗3次。
8、用鑷子小心的去除胚胎的頭和肝臟，PBS洗3次。
9、將胚胎轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，用無菌剪刀將組織充分剪碎，加入0．25％．胰酶，同時吹打幾分鐘使其消化完全。
10、用同樣體積的MEF完全培養(yǎng)基中和胰酶。
11、一個T75瓶加10m1 MEF完全培養(yǎng)基，將已消化的胚胎加入培養(yǎng)瓶中，放在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶注明細(xì)胞名稱、代數(shù)及日期。
二、MEF的傳代
1、將T75瓶中的MEF培養(yǎng)基吸出。
2、加入胰酶，于37℃的CO2培養(yǎng)箱中放置3～5分鐘。
3、取出瓶子，輕輕晃動，可見白色的細(xì)胞層開始從瓶子的底壁掉落。用手掌輕拍瓶側(cè)3～5次加快貼壁細(xì)胞脫落。
4、加入同等體積的MEF培養(yǎng)基，混勻，吹打幾次以形成單細(xì)胞懸浮液。
5、將其轉(zhuǎn)移至15ml離心管，以1000rpm的速度離心5分鐘。
6、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，將上述細(xì)胞均分至若干個新的T75瓶子中，放在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察。
7、吸去培養(yǎng)液，加3ml 0．25％胰酶至完全覆蓋瓶底(以T75為例)。
8、CO2培養(yǎng)箱中孵育3～5分鐘，不時輕拍瓶壁，使細(xì)胞層脫落。
9、加入同等體積的。MEF培養(yǎng)液中和胰酶，吹打混勻。
10、將其轉(zhuǎn)移至15ml離心管，用電子計數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后，以1000rpm的速度離心5分鐘。
11、移去上清，用少量新鮮的MEF培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀。
12、緩慢加入等量的MEF細(xì)胞凍存液(2×)并混勻。
13、分裝上述細(xì)胞懸液于2ml凍存管，在凍存管上注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、數(shù)目、凍存時間。
14、將凍存管放到凍存盒中，-80℃冰箱過夜。根據(jù)需要，將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐中以便長期保存。
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