敲黑板,劃重點(diǎn) | 流式細(xì)胞術(shù)操作重點(diǎn)，一定要看!
中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng) / 2019-04-18 09:05:09
一、針對(duì)樣本的處理
1、觀測(cè)樣本外觀：有嚴(yán)重溶血、凝聚或壞死的樣本應(yīng)棄用。
2、單細(xì)胞懸液的獲?。和庵苎凸撬璐┐桃簽樘烊粏渭?xì)胞懸液;活檢組織常用機(jī)械分離和酶消化兩種方法。不同的實(shí)驗(yàn)要求適用不同的方法。對(duì)于需要進(jìn)行膜抗原標(biāo)記的，不僅是要獲得足夠的單細(xì)胞懸液，還要盡量保證細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性，機(jī)械法較適用。只需進(jìn)行細(xì)胞周期或DNA倍體分析的，在機(jī)械法的基礎(chǔ)上加酶消化(如胰蛋白酶、胃蛋白酶等)較適用。
3、抗凝劑的選擇：外周血標(biāo)本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標(biāo)本做白細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式分析，則應(yīng)用EDTA抗凝;對(duì)于血小板分析的實(shí)驗(yàn)，一般不用肝素抗凝。骨髓穿刺液常用肝素或EDTA抗凝。由于相對(duì)大量的ACD會(huì)通過(guò)改變pH而影響骨髓細(xì)胞活性問題，通常不推薦用ACD作骨髓穿刺液的抗凝劑。
4、樣本的保存：理想狀態(tài)下，樣本應(yīng)在采集后立刻進(jìn)行處理和染色。肝素抗凝的血和骨髓通?？杀４嬷?8-72小時(shí)/室溫(16-25);EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小時(shí)/室溫(16-25); ACD抗凝的外周血可保存至72小時(shí)/室溫(16-25);對(duì)于只作胞內(nèi)染色的樣本，可固定細(xì)胞以長(zhǎng)期保存。但此“固定-染色”的方法取決于要分析的抗原特性和染色方式。
5、去除紅細(xì)胞的方法：細(xì)胞裂解法，操作簡(jiǎn)單、快、并最可能保持原始標(biāo)本的白細(xì)胞分布。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需確認(rèn):
1)抗原性不被溶血過(guò)程改變
2)溶血?jiǎng)┍粡氐紫慈?，?xì)胞和抗體結(jié)合的動(dòng)力反應(yīng)未受影響
3)所用溶血?jiǎng)┎缓潭▌?，否則會(huì)影響細(xì)胞活性及表面標(biāo)記結(jié)果。密度梯度離心法，靶細(xì)胞回收較好并可能得到富集，同時(shí)去除紅細(xì)胞、碎片等，但費(fèi)時(shí)，某些重要細(xì)胞群體可能被選擇性丟失。
6、細(xì)胞與抗體的比例：廠家推薦的抗體用量通常是假定靶細(xì)胞數(shù)量在5X10~1x10范圍內(nèi)。有些標(biāo)本沒有足夠的細(xì)胞，有些則由于細(xì)胞量大，正常濃度下的抗體相對(duì)過(guò)量或不足，導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。因此，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)不同于廠家推薦的方法，調(diào)整細(xì)胞與抗體用量，得到最適的細(xì)胞/抗體比例。
7、細(xì)胞活性的鑒定：死細(xì)胞對(duì)許多抗體均有很強(qiáng)的非特異性染色，這就使樣本細(xì)胞活性檢測(cè)變得非常重要，尤其是經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸和儲(chǔ)存的樣本。檢測(cè)的方法通常有兩種:
1)實(shí)時(shí)的流式檢測(cè):利用熒光染料碘化吡啶(PI)、 7氨基放線菌素D (7-AAD)或EMA (ethidium monoacide) 進(jìn)行死細(xì)胞染色，而活細(xì)胞拒染這些染料。此方法的優(yōu)勢(shì)是細(xì)胞表面標(biāo)志和活性分析可同時(shí)進(jìn)行。尤其適用于高度壞死的樣本。7-AAD最常用，因?yàn)樵?88nm激發(fā)下，其最大發(fā)射光在670nm左右，適合與FITC或PE進(jìn)行多色標(biāo)記。
但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，7Aad會(huì)在固定的細(xì)胞群體重新分配，死活細(xì)胞的區(qū)分變得困難。因此，對(duì)于染色并在固定后12小時(shí)以上分析的標(biāo)本，最好用EMA。EMA與死細(xì)胞DNA穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合保證了長(zhǎng)時(shí)間固定后仍能很好地區(qū)分固定前的死活狀態(tài)。
2)手工檢測(cè):使用Trypan blue或其他細(xì)胞活性染料
熒光淬滅
操作時(shí)必須嚴(yán)格按照孵育時(shí)間，如果抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，熒光是會(huì)逐漸淬滅的。那如果不得不推遲實(shí)驗(yàn)怎么辦？可以把試管放在冰里面，這樣會(huì)稍稍延長(zhǎng)淬滅的時(shí)間。
注意染色順序
在進(jìn)行多熒光染色的時(shí)候，相同的細(xì)胞會(huì)因?yàn)槿旧樞虿煌鴮?dǎo)致熒光強(qiáng)度的差異。解決辦法為：預(yù)實(shí)驗(yàn)。做一系列的不同染色順序的樣本，通過(guò)對(duì)染色前和染色后的各種樣本進(jìn)行比較分析，判斷染色順序?qū)?xì)胞造成的影響。
選好染色方案
染色方案不合理也可能會(huì)導(dǎo)致熒光染色信號(hào)太弱。解決的方案：預(yù)實(shí)驗(yàn)。在正式開始實(shí)驗(yàn)之前，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)出一個(gè)完美的染色方案。（考慮試劑種類，試劑質(zhì)量，試劑用量，孵育時(shí)間，洗滌次數(shù)，染料濃度，染色時(shí)間及染色溫度等其他因素。）
做好陰性對(duì)照及同型對(duì)照試驗(yàn)
細(xì)胞陰性對(duì)照可以顯示細(xì)胞基準(zhǔn)的熒光水平。
同型對(duì)照則是為了查看抗體非特異性結(jié)合的水平。選擇同型對(duì)照需要注意采用相同物種、相同亞類、相同染料、相同濃度，否則，檢測(cè)的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)亂七八糟的同型對(duì)照結(jié)果。
陰性對(duì)照及同型對(duì)照試驗(yàn)
選擇合適的流式抗體
通用原則是：為表達(dá)最弱的抗原選擇染色指數(shù)最高的熒光素。根據(jù)使用的流式細(xì)胞儀性能、激光器、濾光片種類來(lái)選擇。對(duì)于多色實(shí)驗(yàn)，需選擇發(fā)射光譜重疊小的染料。
二、參數(shù)設(shè)定
數(shù)據(jù)的獲取必須是在儀器性能的校準(zhǔn)均合格的基礎(chǔ)上進(jìn)行。儀器散射光和熒光信號(hào)的光電倍增管電壓、增益、顏色補(bǔ)償?shù)葏?shù)的設(shè)定會(huì)直接影響結(jié)果。
電壓調(diào)節(jié)方法
電壓的調(diào)節(jié)需根據(jù)陰性對(duì)照管來(lái)調(diào)節(jié)。
閾值
可以以任意參數(shù)及多個(gè)參數(shù)的組合作為閾值；大多數(shù)樣本都可以設(shè)定FSC/SSC；閾值以下的信號(hào)不存儲(chǔ)；可以根據(jù)陰性對(duì)照管來(lái)調(diào)節(jié)。
目的是將不需要的雜質(zhì)信號(hào)，噪音信號(hào)，無(wú)用的細(xì)胞信號(hào)等扣除，使收集到的都是有用信號(hào)。
熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)方法
流式細(xì)胞分析中經(jīng)常要用到2種以上的熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行染色，而目前所使用的多種熒光染料發(fā)射譜間有一定重疊。熒光補(bǔ)償則可以從探測(cè)器種除去匹配熒光以外的任何熒光信號(hào)。
補(bǔ)償方式：任意兩個(gè)通道之間都可以調(diào)節(jié)。
補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)：根據(jù)單染對(duì)照管來(lái)調(diào)節(jié)。