大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，是人和其他溫血?jiǎng)游锬c道后段的常住菌，終生存在，一般不會(huì)對(duì)人機(jī)體造成傷害，但是在特殊情況下可引起機(jī)體的其他部位感染。致病性大腸桿菌中以O(shè)157∶H7對(duì)人致病性最強(qiáng)， 它屬于EHEC（腸出血性大腸桿菌）， 像通常的致病菌一樣產(chǎn)生細(xì)菌毒素， 可引發(fā)出血性結(jié)腸炎，出血性結(jié)腸炎可發(fā)展為溶血性尿毒綜合征（HUS）和血小板減少性紫癜，嚴(yán)重者可發(fā)生死亡。隨著人們對(duì)食品安全的廣泛關(guān)注，大腸桿菌作為食源性疾病的主要致病菌之一，是病原檢測(cè)的必要項(xiàng)目。食源性疾病病原檢測(cè)技術(shù)是相關(guān)疾病預(yù)防與控制的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要是根據(jù)大腸桿菌的生化特征，進(jìn)行前增菌、選擇性增菌、鏡檢以及血清學(xué)驗(yàn)證。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)病原快速檢測(cè)方法也日新月異，目前主要包括常規(guī)PCR法、基因芯片法、實(shí)時(shí)熒光PCR方法、多重PCR法等，這些方法具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，但是需要較昂貴的儀器和專業(yè)的技術(shù)人員，試驗(yàn)成本也偏高，因此無(wú)法廣泛推廣應(yīng)用。
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，在等溫條件下利用4種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，基因的擴(kuò)增和產(chǎn)物的檢測(cè)可一步完成。應(yīng)用LAMP方法檢測(cè)食品中的大腸桿菌時(shí)有報(bào)道，Hill等。利用LAMP方法快速檢測(cè)出大腸桿菌。苑寧等利用LAMP方法檢測(cè)牛肉中大腸桿菌的靈敏度為1.0 CFU/mL。楊文韜等[10]利用LAMP方法檢測(cè)到牛乳中的大腸桿菌，在63℃下孵育60 min，最低檢出限為547 CFU/mL。Harakudo等[11]利用LAMP方法在60 min內(nèi)就能完成致病菌大腸桿菌的檢測(cè)，靈敏度每個(gè)反應(yīng)體系均大于0.7 CFU。但是在水中檢測(cè)大腸桿菌的報(bào)道較少。劉莎等[12]利用LAMP方法對(duì)常規(guī)水質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度為每個(gè)反應(yīng)體系10 CFU。另外，LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)包括以下 3 種方式：（1）SYBR Green Ⅰ檢測(cè)，在反應(yīng)液中加入SYBR Green Ⅰ，可在紫外燈或日光下通過肉眼判定擴(kuò)增結(jié)果，如果含有擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)混合液變綠；反之，則混合液保持橙色；（2）副產(chǎn)物-焦磷酸鎂的濁度檢測(cè)，這種檢測(cè)方式具有極高的特異性，使用濁度儀或肉眼觀察就能夠判斷擴(kuò)增與否；（3）瓊脂糖電泳檢測(cè)，因LAMP產(chǎn)物均為初始結(jié)構(gòu)的整數(shù)倍，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后形成特異的梯狀條帶。
本研究利用大腸桿菌的malB基因設(shè)計(jì)LAMP特異引物，通過對(duì)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、dNTPs和甜菜堿濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了快速檢測(cè)飲用水中大腸桿菌的LAMP反應(yīng)體系，為飲用水中重要致病菌的檢測(cè)提供一種快速準(zhǔn)確的技術(shù)手段。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
本研究所用菌種包括2株大腸桿菌目的菌株和金黃葡萄球菌等9株非目標(biāo)菌株。
1.2 試劑與儀器
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 LAMP引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中公布的大腸桿菌malB基因序列（EU118059.1），利用在線引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer V4設(shè)計(jì)LAMP引物，4條引物分別為兩條內(nèi)引物（FIP/BIP）和兩條外引物（F3/B3），
1.3.2 DNA模板的制備 將大腸桿菌菌株接種于YT培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)，并將培養(yǎng)好的菌株按照TIANGEN細(xì)菌提取試劑盒說明書要求進(jìn)行基因組DNA的提取。利用核酸定量測(cè)定儀測(cè)定提取基因組DNA的質(zhì)量，-20℃保存?zhèn)溆谩?nbsp;
1.3.3 LAMP技術(shù)檢測(cè)大腸桿菌反應(yīng)條件的優(yōu)化 LAMP反應(yīng)體系由外引物（F3/B3）、內(nèi)引物（FIP/BIP）、BstDNA聚合酶、緩沖液、dNTPs、甜菜堿、ddH2O和核酸模板組成。對(duì)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、dNTPs濃度和甜菜堿等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系。反應(yīng)溫度在50.0～70.0℃之間，按照5℃梯度遞增；反應(yīng)時(shí)間在30～70 min之間按照10 min的反應(yīng)梯度遞增；dNTPs設(shè)置5個(gè)濃度，依次為0.05、0.1、0.2、0.3 mmol/L和0.4 mmol/L，在試驗(yàn)過程中保持等量模板和一個(gè)變量。在其他條件均優(yōu)化好的前提下，分別加4 mol/L的甜菜堿0.25、0.5、0.75、1.0 μL和1.25 μL梯度進(jìn)行試驗(yàn)，取5.0 μL LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定最佳的反應(yīng)條件。
1.3.4 LAMP特異性試驗(yàn) 利用優(yōu)化后的反應(yīng)條件，對(duì)大腸桿菌目的菌株和金黃葡萄球菌等9株非目標(biāo)菌株進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，應(yīng)用曬餿玖霞SYBR Green Ⅰ進(jìn)行顯色，在紫外光下觀察檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，并將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的特異性。
1.3.5 LAMP靈敏度試驗(yàn) 取過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液，然后按10倍濃度梯度稀釋至10-8，原始菌液濃度為1.35×106 CFU/mL，37℃平板上過夜培養(yǎng)，測(cè)定純培養(yǎng)的大腸桿菌的活菌數(shù)。同時(shí)將各稀釋菌液利用TIANGEN細(xì)菌提取試劑盒提取DNA，取2.0 μL作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，檢測(cè)該方法的靈敏度。
1.3.6 LAMP檢測(cè)大腸桿菌方法的驗(yàn)證 10種不同品牌的純凈水，經(jīng)16S rDNA鑒定均為陰性樣本，將每種純凈水各取1.5 mL分別加入500 μL大腸桿菌菌液，以不加任何目的菌液的純凈水為對(duì)照。所測(cè)樣品采用TIANGEN細(xì)菌基因組試劑盒提取DNA，按照優(yōu)化后LAMP反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增，取5.0 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。同時(shí)根據(jù)反應(yīng)之前加入的SYBR Green Ⅰ熒光染料在紫外燈下進(jìn)行檢測(cè)，若顏色呈現(xiàn)綠色則判讀為陽(yáng)性。
2 結(jié)果與分析
2.1 LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的確定
根據(jù)試驗(yàn)條件參數(shù)的優(yōu)化，大腸桿菌最佳的反應(yīng)體系為：F3/B3（0.4 μmol/L）1.0 μL，F(xiàn)IP/BIP（2.4 μmol/L）3.0 μL，BstDNA 聚合酶（8 U/μL）1.0 μL，甜菜堿（4 mol/L） 0.75 μL，酶緩沖液2.5 μL，dNTPs（0.2 mmol/L）2.0 μL，DNA模板（10 ng/μL） 2.0 μL，補(bǔ)水至25 μL。通過梯度試驗(yàn)條件優(yōu)化，最終確定大腸桿菌反應(yīng)條件為60℃ 60 min，80℃ 5 min終止反應(yīng)。
2.2 LAMP特異性驗(yàn)證
根據(jù)建立的LAMP反應(yīng)體系和條件，對(duì)大腸桿菌和非目標(biāo)菌（金黃葡萄球菌、化膿鏈球菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、陰溝腸桿菌、赫氏埃希氏菌、停乳鏈球菌、嗜熱乳酸鏈球菌、解淀粉芽孢桿菌）進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，大腸桿菌擴(kuò)增出階梯狀條帶，且清晰，其他非目標(biāo)菌株均未擴(kuò)增出條帶，表明LAMP擴(kuò)增對(duì)大腸桿菌具有較好的特異性。在反應(yīng)之前加入SYBR Green Ⅰ熒光染料，等反應(yīng)結(jié)束在紫外燈下觀察，大腸桿菌組呈現(xiàn)綠色。
2.3 LAMP靈敏度試驗(yàn)
對(duì)大腸桿菌的純培養(yǎng)菌液按10倍梯度進(jìn)行稀釋后分別提取基因組DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，然后取5.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)?？梢钥闯觯♂尩?0-6時(shí)（大腸桿菌濃度為1.35 CFU/mL）仍能擴(kuò)增出階梯狀條帶，繼續(xù)稀釋則沒有擴(kuò)增條帶。因此，LAMP擴(kuò)增檢測(cè)大腸桿菌靈敏度達(dá)到1.35 CFU/mL，證明LAMP技術(shù)具有較高的靈敏度。
2.4 供試樣品檢測(cè)
對(duì)供試樣本按照優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，取5.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，未添加大腸桿菌的純凈水樣品均為陰性，加入大腸桿菌的供試樣本檢測(cè)均為陽(yáng)性。紫外光下加入大腸桿菌的純凈水樣品顏色為綠色，判讀為陽(yáng)性。
3 討論與結(jié)論
受到致病性大腸桿菌污染的水會(huì)危害人體健康，能夠引起中毒，導(dǎo)致嘔吐、腹瀉等癥狀。對(duì)于大腸桿菌的快速檢測(cè)主要集中于以PCR為基礎(chǔ)的分子檢測(cè)方面，但相關(guān)PCR檢測(cè)需要昂貴的設(shè)備，在基層檢測(cè)上很難得到推廣應(yīng)用。本研究建立的LAMP擴(kuò)增技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)：
1）操作簡(jiǎn)便，避免污染。試驗(yàn)操作過程中可以一次性加入試劑、合成酶和SYBR Green Ⅰ染色劑，可以有效避免開蓋過程中的交叉污染，避免造成假陽(yáng)性影響檢測(cè)結(jié)果，產(chǎn)生試驗(yàn)誤差。
2）試驗(yàn)需要的儀器要求低，價(jià)格便宜。LAMP體系擴(kuò)增反應(yīng)保持在60℃左右，因此試驗(yàn)過程中只需要恒溫PCR儀或恒溫水浴鍋即可完成反應(yīng)，與熒光PCR擴(kuò)增技術(shù)相比，不需要昂貴的檢測(cè)設(shè)備。判定結(jié)果除可使用凝膠電泳法檢測(cè)外，還可利用熒光染料在紫外燈下直接觀測(cè)。
3）特異性強(qiáng)，靈敏度高。本研究中大腸桿菌的檢測(cè)靈敏度為1.35 CFU/mL。
恒溫介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）與其他分子生物學(xué)技術(shù)相比，具有較高的靈敏度。Yokoyama等也報(bào)道了LAMP擴(kuò)增技術(shù)與PCR擴(kuò)增相比具有較高靈敏度。Wang等利用MERT-LAMP檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌靈敏度達(dá)到125 fgDNA/反應(yīng)。在不同的試驗(yàn)中檢測(cè)靈敏度存在較大差別，可能與引物設(shè)計(jì)時(shí)選擇的靶基因不同有關(guān)，也可能與反應(yīng)體系中化學(xué)試劑、酶活性、金屬離子濃度有關(guān)。目前，在食品致病菌方面報(bào)道的大腸桿菌靶基因有LT、VT、rfbE和malB，本研究選擇的malB基因具有高度保守性，可以特異性地?cái)U(kuò)增出大腸桿菌。該方法可以對(duì)大腸桿菌進(jìn)行有效的檢測(cè)，為水中致病菌的檢測(cè)提供廣泛快速的技術(shù)手段。