副溶血弧菌（Vibio parahaemolyticus，VP）是一種革蘭陰性的彎曲棒狀菌，具有嗜鹽性，主要存在于近海岸的海水、海水沉積物及浮游生物、魚、蝦、蟹、貝類等海產(chǎn)品中，是海產(chǎn)品常見的致病菌，被列為全球最重要的食源性病原菌之一。副溶血弧菌感染主要臨床表現(xiàn)為上腹部陣發(fā)性絞痛，嘔吐，腹瀉，水樣便（有時膿血便）等胃腸道癥狀，重癥者可能出現(xiàn)脫水、意識不清、血壓下降等。世界首例報道的副溶血弧菌食物中毒是1950年10月發(fā)生于日本大阪的沙丁魚中毒事件，造成272人中毒，20人死亡。此后，副溶血弧菌中毒在世界各地報道屢見不鮮。1992―2001年間，我國13個監(jiān)測地區(qū)上報的5.000余例食源性疾病中，微生物引起的食物中毒占38.5%，其中副溶血弧菌占了31.1%，超過沙門氏菌成為首要病原菌。因此，研究副溶血弧菌的快速、準(zhǔn)確的檢測方法非常重要。
目前對副溶血弧菌的檢測主要為分子生物學(xué)方法和分析化學(xué)方法，從細胞水平和分子水平來檢測副溶血弧菌，包括PCR檢測和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法等[5]。國標(biāo)（GB 4789.7―2013）對副溶血弧菌的檢測包括生化試驗及血清學(xué)試驗或神奈川試驗，需在3%氯化鈉堿性蛋白胨水內(nèi)增菌后，在3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板純培養(yǎng)18～24 h，神奈川試驗還需接種在我妻氏血瓊脂平板培養(yǎng)不超過24 h，整個過程需要5～7 d，培養(yǎng)過程較長，實驗過程較繁瑣，耗時較久。
本研究以微生物基因組計劃（Microbial Genome Program，MGP）為背景，在傳統(tǒng)PCR方法的基礎(chǔ)上，應(yīng)用恒溫?zé)晒釶CR方法及快速檢測試劑盒對副溶血弧菌進行檢測，該方法無需熱循環(huán)，持續(xù)擴增，使用Bst DNA聚合酶，高效擴增，引物成啞鈴狀，存在莖環(huán)結(jié)構(gòu)，能自主擴增，另外反應(yīng)底物濃度高，能提高低拷貝模板的擴增概率。并且該恒溫?zé)晒夥ㄓ糜诂F(xiàn)場副溶血性弧菌檢測，操作便捷，檢出迅速，具有一定優(yōu)勢。
1 材料與方法
1.1 儀器與材料
恒溫擴增熒光檢測儀（Deaou-308C），相關(guān)快速試劑盒―副溶血弧菌核酸恒溫檢測試劑盒（產(chǎn)品編號：FA101S；包裝規(guī)格：24測試/盒）。試劑盒內(nèi)包括Bst DNA聚合酶，反應(yīng)緩沖液，密封液，陰性對照，陽性對照，DNA提取液；細菌基因組DNA快速提取試劑盒。恒溫擴增熒光檢測儀（Deaou-308C）采用安卓系統(tǒng)，30 s一次實時監(jiān)測，內(nèi)置觸摸屏，采用數(shù)學(xué)模型進行數(shù)據(jù)處理和圖形繪制，可自動判讀結(jié)果，陽性結(jié)果成S型曲線。
標(biāo)準(zhǔn)副溶血弧菌菌株ATCC17802，
1.2 擴增基因的引物序列
用于基因擴增的引物序列，即LAMP引物序列見表1。
1.3 實驗方法
實驗分為三個部分：實驗室自配樣品測試階段，腹瀉樣本檢測階段，市場食品樣本檢測階段。實驗室自配樣品測試階段是為了測試機器及試劑的穩(wěn)定性及試劑的最低檢測限；腹瀉樣本及市場食品樣本檢測階段是為了測試機器及試劑針對不同樣本的適用范圍與檢測準(zhǔn)確度。
反應(yīng)體系操作流程如下：
① DNA模板制備：將樣品增菌液搖勻稍靜止，取增菌液1 mL，10.000 r/min離心3 min，棄凈上清液；渦旋混勻DNA提取液，向沉淀中加入100μL DNA提取液，渦旋混勻，100℃加熱5 min；10.000 r/min離心3 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管備用，即為模板。
?、?反應(yīng)體系配制：若有n個待檢樣品，需配制n+2反應(yīng)液（n個待檢樣品+1個陰性對照+1個陽性對照），將試劑在EP管中混勻，按每管23 μL分裝至0.2 mL PCR管中，分別向每管中加入20 μL的密封液。
?、?加樣：在上述含有混勻試劑的PCR管中加入2 μL模板（加樣順序為陰性對照、待檢樣品、陽性對照），蓋好管蓋，10.000 r/min離心30 s。
?、?擴增反應(yīng)：63℃反應(yīng)45 min。
結(jié)果判定：若有“S”型擴增曲線且出峰時間
2.2 腹瀉病人生物樣本模擬測試階段
由于副溶血弧菌感染起病急，對于體弱的患者，感染引發(fā)的敗血癥會有危及生命的危險，其進入患者血液并分布到全身的過程引起敗血癥，最終會導(dǎo)致失血性休克、全身性多器官衰竭甚至死亡[8]。研究表明，上海市居民每人每天通過水產(chǎn)品攝入導(dǎo)致副溶血弧菌感染的概率均值為1.2×10-6，按《2014上海統(tǒng)計年鑒》中上海市常住人口2.415萬人計，上海市居民每年通過食用水產(chǎn)品導(dǎo)致致病性副溶血性弧菌感染而患病人數(shù)約為10.746人[9]。因此，對于疑似感染副溶血弧菌的腹瀉病人的樣本正確及時檢出顯得尤為重要。
采集市售腹瀉樣本20份，由第三方檢測公司按國標(biāo)檢測后，結(jié)果為：腹瀉樣中檢測出的菌為大腸O157：H7，不含有沙門菌，李斯特菌，副溶血性弧菌等三種實驗需檢測的菌。按照國標(biāo)培養(yǎng)副溶血弧菌增菌液，任意取15份腹瀉樣上清9 mL，加入1 mL菌液，使樣本的含菌量達到103～104 cfu/mL，搖勻，分裝成三份。剩余5份腹瀉樣本取上清10 mL，搖勻，分裝成三份。制成3組平行樣本，每組20份，分發(fā)至三個實驗室進行檢測。
2.3 市場食品樣測試階段
采集市售水產(chǎn)品樣本30份，實驗前或?qū)嶒炌瑫r，由上海市營養(yǎng)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站按國標(biāo)對30件水產(chǎn)品中的副溶血弧菌進行定量測試，以此作為結(jié)果比對的金標(biāo)準(zhǔn)。測試結(jié)果中有5份陽性，將陽性樣本一分為二。取5份陰性樣本，按國標(biāo)培養(yǎng)副溶血弧菌菌液后接種，使樣本含菌量達10.000 cfu/mL，將陽性樣本一分為二，共計陰性樣本10份，國標(biāo)檢測出陽性樣本10份，接種陽性樣本10份，共30份。將30份樣本平分為3份，分發(fā)至三個實驗室進行檢測。
3 結(jié)果
3.1 實驗室自配陽性樣品測試階段結(jié)果
8個陽性樣本在6次試驗中均被檢出，陽性檢出率為100%，陰性樣本有一次被檢出為假陽性，準(zhǔn)確率為91.7%（表2）。該方法對100 cfu/mL的菌液仍有很好的檢測率，且陽性樣本均能在30 min內(nèi)出現(xiàn)S型擴增曲線出峰。
3.2 腹瀉病人生物樣本測試階段結(jié)果
5個陰性樣品在6次試驗中出現(xiàn)了較多假陽性，準(zhǔn)確率為50%，可能是由于操作導(dǎo)致底物或陰性樣本污染；15個接種菌樣的樣品在6次試驗中僅出現(xiàn)一次假陰性，檢出率為98.9%（表3）。
3.3 市場食品樣測試階段結(jié)果
實驗室3陽性結(jié)果檢測時間缺失，僅有陰陽性結(jié)果。檢測結(jié)果中陽性品檢出與樣本陽性一致，檢出率為100%；陰性的準(zhǔn)確率偏低，假陽性較多，準(zhǔn)確率為51.7%（表4）。
4 討論
實驗各階段靈敏度、特異度分析如表5。
實驗室自配樣品檢測靈敏度、特異度、真陽性率、真陰性率都高，證實了儀器及試劑盒的穩(wěn)定性與可靠性，僅一例陰性樣本在40 min時出現(xiàn)假陽性，可能為操作中的交叉污染導(dǎo)致。
腹瀉陽性樣本基本都能檢出（98.9%），市場樣本100%檢出，說明該試劑盒穩(wěn)定性良好，適用范圍較廣。僅有一例出現(xiàn)假陰性，在試驗試劑嚴(yán)格配置正確的情況下應(yīng)該可以避免此現(xiàn)象發(fā)生。然而兩者均有較多的假陽性樣本，可能在菌液分裝過程中導(dǎo)致交叉污染，或是配置檢測試劑時導(dǎo)致污染。實驗操作應(yīng)在無菌臺上操作，實驗室應(yīng)保持通風(fēng)良好，避免操作過程中的污染。由于實驗室條件限制，以及操作人員的不熟練，導(dǎo)致假陽性檢測的產(chǎn)生，在今后應(yīng)用過程中應(yīng)予以注意。若剔除30 min后轉(zhuǎn)為陽性的樣本，將其歸為陰性，則各階段靈敏度、特異度分析見表6。
可見當(dāng)剔除30 min后轉(zhuǎn)為陽性的樣本后，特異度顯著提高，試劑盒規(guī)定儀器檢測時間為45 min，許多假陽性樣本由于污染，樣本內(nèi)菌液濃度不高，均在30 min甚至40 min后才轉(zhuǎn)為陽性，可以考慮將檢測時間縮短至30～35 min，會大大降低假陽性發(fā)生的可能性。
本研究所使用的?性樣本菌液大多為實驗室根據(jù)國標(biāo)配置，與市售污染水產(chǎn)品或?qū)嶋H腹瀉病人樣品中副溶血弧菌的真實生長繁殖環(huán)境及菌液濃度可能存在一定的差異，后期有必要增加實際受污染的樣品做進一步的復(fù)檢。
該恒溫擴增熒光PCR檢測方法及快速檢測試劑盒穩(wěn)定有效，靈敏度極高，且適用范圍廣，對腹瀉樣本及市場食品樣本均有良好的檢出率，且操作簡單，耗費經(jīng)濟，對我國食品中副溶血弧菌檢測具有重要意義。實驗過程中仍需要謹(jǐn)慎操作，控制適宜的實驗條件，盡可能減少假陽性檢測的發(fā)生，提高特異度，進一步擴大該檢測方法的使用范圍和接受程度。