直接免疫熒光法檢測(cè)細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)
中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng) / 2019-01-28 09:02:41
直接免疫熒光法是熒光抗體技術(shù)中最簡(jiǎn)單、最基本的一種染色法。當(dāng)某種熒光抗體直接與相應(yīng)的被檢抗原相遇時(shí)，則發(fā)生特異性反應(yīng)。直接染色法的優(yōu)點(diǎn)是：特異性高、操作簡(jiǎn)便、比較快速。缺點(diǎn)是：一種標(biāo)記抗體只能檢查一種抗原。另外，該法的敏感性也較差。
直接免疫熒光法檢測(cè)細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)
直接免疫熒光技術(shù)已被廣泛用于細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，標(biāo)本材料可以是細(xì)菌培養(yǎng)物、感染組織、病畜分泌、排泄物等，相比于其它鑒定細(xì)菌的血清學(xué)方法，該方法快速、操作簡(jiǎn)單、敏感性高。已有文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用熒光抗體技術(shù)檢測(cè)沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌( O1群、O139群)、兔波氏桿菌、鰻弧菌等。
一、基本原理
將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低，而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
二、試劑與儀器
（1）磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
（2）熒光標(biāo)記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋
（3）緩沖甘油：9份分析純無(wú)熒光的甘油+1份PBS配制
（4）熒光顯微鏡
（5）玻片架
（6）濾紙
（7）37°C溫箱等。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、標(biāo)本制備
（1）涂片標(biāo)本方法：先將載玻片通過(guò)火焰3次，冷卻后，以接種環(huán)（或鉑金耳）挑選被檢材料均勻涂布成直徑約1cm的圓形涂片。如材料太濃，則應(yīng)預(yù)先加適量滅菌生理鹽水于另一玻片上，用接種環(huán)挑取材料與其混合稀釋?zhuān)鶆蚝笸科?，也可將生理鹽水加入被檢材料中，混合均勻后涂片。涂好后，自然晾干。
（2）壓印標(biāo)本方法：用無(wú)菌剪子將待檢組織標(biāo)本剪開(kāi)，用無(wú)菌清潔棉球或?yàn)V紙將切面的血液吸干，然后以載玻片輕壓切面，使之沾上1-2層細(xì)胞，然后再在玻片另一處以切面涂拭，得一較厚抹片，將標(biāo)本自然晾干。
2、標(biāo)本固定：被檢標(biāo)本的固定是免疫熒光技術(shù)中的重要環(huán)節(jié)，往往對(duì)熒光染色效果有明顯的影響。除了研究細(xì)胞表面抗原可不固定外，一般均應(yīng)先固定，然后再進(jìn)行熒光抗體染色。細(xì)菌免疫熒光常用的固定劑有丙酮、10%甲醛或甲醇，固定條件為室溫3-10min或4°C 30-60min。
3、將固定好的玻片標(biāo)本置于濕盤(pán)中，滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。
4、滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其完全覆蓋標(biāo)本區(qū)。
5、將玻片置于帶蓋的不透光容器內(nèi)（底部墊以濾紙，紙上放玻片架，加適量水使濾紙浸濕，玻片數(shù)量少時(shí)可用平皿，內(nèi)置2-3個(gè)浸濕的棉球），密蓋，放置于37°C溫箱染色30min左右（溫度和時(shí)間根據(jù)標(biāo)本情況而定）。
6、取出玻片，置玻片架上，先以PBS沖去未結(jié)合的標(biāo)記抗體液，然后置大量PBS中漂洗15min，或使用去離子水或蒸餾水緩緩沖洗玻片多次后甩干，然后浸泡于PBS中1min。
7、取出玻片，用濾紙吸去多余水分，保持標(biāo)本濕潤(rùn)，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。
8、立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度用以下符號(hào)表示：
-：無(wú)熒光；
±：極弱的可疑熒光；
+：熒光較弱，但清楚可見(jiàn)；
++：熒光明顯，呈黃綠色；
+++：熒光明亮，呈明顯的綠色；
++++：熒光閃亮，呈耀眼的亮綠色。
待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上，而各種對(duì)照顯示為（±）或（-），即可判定為陽(yáng)性。
四、注意事項(xiàng)
1、對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋?zhuān)ＷC抗體的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過(guò)1:20，抗體濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過(guò)弱，影響結(jié)果的觀察。
2、染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)標(biāo)本的不同而變化，染色時(shí)間可以從10 min到數(shù)小時(shí)，一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25°C左右），37°C可加強(qiáng)染色效果。對(duì)不耐熱抗原可采用0-2°C的低溫，延長(zhǎng)染色時(shí)間。通常低溫染色過(guò)夜較37°C染色30min效果好。
3、為了保證熒光染色的準(zhǔn)確性，首次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置以下對(duì)照，以排除非特異性熒光染色的干擾。
（1）標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：不加熒光抗體，標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
（2）特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。
（3）陽(yáng)性對(duì)照：已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。
如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光，陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽(yáng)性染色。
4、經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。
5、免疫熒光在封片時(shí)可以購(gòu)買(mǎi)使用專(zhuān)用封片劑。
6、熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理盡量避光操作。