中國微生物菌種查詢網(wǎng) 目前被認(rèn)為是一項(xiàng)簡便、快速、敏感性和特異性好的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，由于采用的是非特異性美蘭染色方法，樣品中各種藥品的固形成分可被不同程度的染上色，檢測樣品培養(yǎng)時(shí)間長時(shí)，有部分菌形成的菌膜與微菌落相混淆，而存在著非特異性問題。本檢出法中依據(jù)致病菌在含有特異熒光抗體的液體增菌培養(yǎng)基中，能快速粘連性分裂增殖形成熒光免疫微菌落，采用熒光顯微鏡快速檢出藥品中致病菌。目前國內(nèi)還未見報(bào)道。作者采用免疫熒光微菌落法快速檢出藥品中致病菌，為藥品中致病菌的檢測建立了一種簡便、快速的方法，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。
1實(shí)驗(yàn)材料
1.1痢疾桿菌菌株：F1a、F2a、F3a、F4a、F5、F6和宋內(nèi)氏痢疾桿菌。菌種均來自湖南省疾病預(yù)防控制中心和本所保存菌株。
1.2痢疾桿菌熒光抗體制備：按文獻(xiàn)報(bào)道【2】免疫家兔制備成宋內(nèi)氏痢疾桿菌和F1a、F2a、F3a、F4a、F5、F6痢疾桿菌7個(gè)型免疫血清、試管凝集效價(jià)：宋內(nèi)氏痢疾桿菌為 1:4600，F(xiàn)1-F6均為1：3200以上的7種免疫血清，根據(jù)效價(jià)按比例混合后，再用硫酸銨鹽析法提取免疫血清中抗體蛋白，用熒光素標(biāo)記此抗體蛋白和純化熒光抗體，實(shí)驗(yàn)用稀釋度為1:20.
1.3試驗(yàn)用中成藥：歸脾丸、六味地黃丸、十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、驢膠補(bǔ)血沖劑、川貝止咳糖漿、玉竹膏、雪梨膏，均來自本所中藥檢測室。
1.4免疫熒光微菌落增菌液：按常規(guī)方法配制蛋白胨水，高壓滅菌冷卻后按1:20（免疫熒光抗體：蛋白胨水）比例混勻制成。
1.5免疫熒光顯微鏡：XSZ—HY1熒光顯微鏡，重慶光電儀器總公司重慶光學(xué)儀器廠生產(chǎn)。
2實(shí)驗(yàn)方法
2.1供試樣品制備：在Ⅱ級(jí)生物安全柜中，以無菌方法分別將宋內(nèi)氏和F2a、F3a痢疾桿菌分別植入藥丸中，用無菌生理鹽水稀釋成1:10混懸液；沖劑用無菌生理鹽水1:10稀釋成混懸液；液體制劑直接用滅菌生理鹽水1:1稀釋制成混懸液；糖漿劑直接用原液，三種稀釋后的混懸液各分三管，再分別加入宋內(nèi)氏和F2a、F3a痢疾桿菌制成混懸液。
2.2標(biāo)本制作：用增菌蛋白胨水培養(yǎng)基1:20稀釋免疫熒光抗體，混合均勻后，滴加在凹玻片的凹孔中，每孔100μl。用接種環(huán)將待檢樣品一鉑環(huán)接種在含免疫熒光抗體凹玻片的凹孔中，混勻，再置濕盒中37℃培養(yǎng)4-6小時(shí)，取出后再熒光顯微鏡低倍鏡下進(jìn)行觀察。（物鏡10x，目鏡5x）進(jìn)行免疫熒光微菌落法檢測時(shí)，每份樣品同時(shí)用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法作平行試驗(yàn)。
2.3陽性結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)：在熒光顯微鏡下，免疫熒光微菌落的亮度從強(qiáng)到弱，用“++++、+++、++、+”表示，如果免疫熒光微菌落結(jié)構(gòu)疏松，呈雪花狀或網(wǎng)狀樣，亮度在“++”以上時(shí),發(fā)現(xiàn)一個(gè)免疫熒光微菌落，即可判定為陽性。
2.4傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)驗(yàn)證方法：采用免疫熒光微菌落陽性培養(yǎng)液，接種在SS平皿和麥康凱平板上，放37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，挑取可疑菌落接種三糖鐵生化管，再用志賀氏菌屬分型血清作玻片血清凝集，作為免疫熒光微菌落的證實(shí)試驗(yàn)。
3結(jié)果
用免疫微菌落法和傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法同時(shí)檢測24份加入痢疾桿菌的樣品。經(jīng)37℃，4-6小時(shí)培養(yǎng)后，免疫熒光微菌落法均能檢測出亮度“+++”以上的熒光微菌落，而傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法僅檢測出18份加入痢疾桿菌的樣品，表明免疫熒光微菌落法優(yōu)于常規(guī)法。檢測10份不加痢疾桿菌的空白對照樣品和10份中成藥混懸液中加入正常人糞便的樣品，結(jié)果在熒光顯微鏡下均未發(fā)現(xiàn)有免疫熒光微菌落形成，表明免疫熒光微菌落法有較好的特異性，檢測結(jié)果基本可靠。
4 討論
4.1免疫熒光微菌落法的特點(diǎn)是采用熒光素標(biāo)記特異性抗體在含有相應(yīng)抗原（致病菌）的免疫液體增殖液中粘連性分裂增殖，經(jīng)過37℃4-6小時(shí)的培養(yǎng)，可形成免疫熒光微菌落（類似于培養(yǎng)皿上的菌落），在熒光顯微鏡下容易被觀察到，理論上講，在顯微鏡下只要找到一個(gè)免疫熒光微菌落即可判定為陽性，所以本法有較高的靈敏度【3】。
4.2免疫熒光微菌落法與免疫微菌落染色法比較，由于熒光素標(biāo)記在特異性抗體上，故免疫熒光微菌落法減少培養(yǎng)后微菌落的染色過程，使其特異性得到了很大的提高，由于檢測的樣品可在凹玻片上的凹孔中微量培養(yǎng)，取出后即可置熒光顯微鏡下直接觀察結(jié)果，操作簡便，提高了工作效率。
4.3免疫熒光微菌落法是將免疫學(xué)抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)與細(xì)菌的液體培養(yǎng)法有機(jī)結(jié)合，使致病菌在含有相應(yīng)的熒光抗體的液體培養(yǎng)基中不斷地凝集性快速生長繁殖，生長繁殖的致病菌又與相應(yīng)的熒光抗體再結(jié)合，經(jīng)過37℃4-6小時(shí)培養(yǎng)，可形成直徑100μm左右的免疫熒光微菌落。因抗原抗體結(jié)合是特異性的，故本法具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)。據(jù)此，可用其他致病菌的免疫熒光血清，亦可檢測出藥品中的其他致病菌，因此，免疫熒光微菌落法可作為藥品衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)的一項(xiàng)比較理想快速診斷技術(shù)。