實(shí)驗(yàn)原理
感受態(tài)是指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。感受態(tài)由受體細(xì)胞的遺傳性狀所決定的，受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。cAMP可提高感受態(tài)水平一萬(wàn)倍，而Ca2+存在也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。新鮮，幼嫩的細(xì)胞是選擇做感受態(tài)細(xì)胞的材料。
感受態(tài)細(xì)胞在0℃，CaCl2的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，而轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羥基--鈣磷酸復(fù)合物，并粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理，可促使細(xì)胞迅速收縮，吸收DNA復(fù)合物，完成轉(zhuǎn)化。
實(shí)驗(yàn)材料
大腸桿菌DH5α菌株，LB固體培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)液，0.1M CaCl2溶液，20%無(wú)菌甘油。
恒溫培養(yǎng)箱，冷凍離心機(jī)，無(wú)菌工作臺(tái)
實(shí)驗(yàn)過(guò)程
1、從-20℃冰箱中取出保種的DH5α菌株，用滅菌的槍頭挑取少量保菌液，在LB固體培養(yǎng)基上劃線處理，并與37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。
2、第二天，從LB固體培養(yǎng)基上挑取濕潤(rùn)，圓滑的單菌落，放入到LB培養(yǎng)液中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)（約16h）。
3、將該菌液按照1:100～1:50的比例，轉(zhuǎn)接于新鮮的100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開(kāi)始出現(xiàn)混濁后，每隔20～30min測(cè)一次OD600，當(dāng)OD600值為0.3-0.5時(shí)停止培養(yǎng)；
4、將菌液轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的離心管中，冰浴30min，在4℃條件下，4000r／min離心10min。
5、棄掉上清液，用1ml預(yù)冷的 CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，4℃條件下，4000r／min離心10min。
6、重復(fù)步驟4一次。
7、棄去上清液，加入100μl預(yù)冷的CaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液。
8、制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可加入等體積的20%甘油（已滅菌處理）混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70℃條件保存。
注意事項(xiàng)
1、為制備轉(zhuǎn)化效率較高的感受態(tài)細(xì)胞，可將保種液經(jīng)劃線和二次培養(yǎng)以后用于制作感受態(tài)細(xì)胞。
2、注意挑取LB固體培養(yǎng)基上濕潤(rùn)，圓滑的克隆，以防挑取雜菌。
3、進(jìn)行二次培養(yǎng)的時(shí)候，搖床轉(zhuǎn)速應(yīng)選擇較低轉(zhuǎn)速，空載轉(zhuǎn)速在100-150轉(zhuǎn)/min左右。
4、制作感受態(tài)的過(guò)程中盡量冰上操作，操作的動(dòng)作盡量輕柔，穩(wěn)健；試驗(yàn)中所用的試劑，轉(zhuǎn)子，離心機(jī)需要提前預(yù)冷。
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