間接免疫熒光法檢測(cè)細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)方法和注意事項(xiàng)！
中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng) / 2018-11-29 10:19:08
中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng) 間接免疫熒光染色法的優(yōu)點(diǎn)是：既能檢查未知抗原，也能檢查未知抗體；用一種標(biāo)記的抗球蛋白抗體，就能與在種屬上相同的所有動(dòng)物的抗體結(jié)合，檢查各種未知護(hù)抗原或抗體；另外，本法的敏感性較高，通常比直接染色法高5-10倍。
缺點(diǎn)是：由于參與反應(yīng)的因素較多，受干擾的可能性也較大，因此結(jié)果判定有時(shí)較難；另外操作方法比較繁瑣，需要做的對(duì)照較多，時(shí)間也較長(zhǎng)。
一、試劑與儀器
（1）磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
（2）熒光標(biāo)記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋
（3）緩沖甘油：9份分析純無(wú)熒光的甘油+1份PBS配制
（4）熒光顯微鏡
（5）玻片架
（6）濾紙
（7）37°C溫箱等。
二、實(shí)驗(yàn)方法
1、標(biāo)本制備
（1）涂片標(biāo)本方法：先將載玻片通過(guò)火焰3次，冷卻后，以接種環(huán)（或鉑金耳）挑選被檢材料均勻涂布成直徑約1cm的圓形涂片。如材料太濃，則應(yīng)預(yù)先加適量滅菌生理鹽水于另一玻片上，用接種環(huán)挑取材料與其混合稀釋，待均勻后涂片，也可將生理鹽水加入被檢材料中，混合均勻后涂片。涂好后，自然晾干。
（2）壓印標(biāo)本方法：用無(wú)菌剪子將待檢組織標(biāo)本剪開，用無(wú)菌清潔棉球或?yàn)V紙將切面的血液吸干，然后以載玻片輕壓切面，使之沾上1-2層細(xì)胞，然后再在玻片另一處以切面涂拭，得一較厚抹片，將標(biāo)本自然晾干。
2、標(biāo)本固定：被檢標(biāo)本的固定是免疫熒光技術(shù)中的重要環(huán)節(jié)，往往對(duì)熒光染色效果有明顯的影響。除了研究細(xì)胞表面抗原可不固定外，一般均應(yīng)先固定，然后再進(jìn)行熒光抗體染色。細(xì)菌免疫熒光常用的固定劑有丙酮、10%甲醛或甲醇，固定條件為室溫3-10min或4°C 30-60min。
3、將固定好的玻片標(biāo)本置于濕盒中，吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清加于標(biāo)本上，于37°C作用30min。
4、取出載玻片，先以PBS沖去未結(jié)合的標(biāo)記抗體液，然后置大量PBS中漂洗15min，或使用去離子水或蒸餾水緩緩沖洗玻片多次后甩干，然后浸泡于PBS中1min。
5、取出載玻片，用吸水低吸干余留的液體。
6、滴加相應(yīng)的抗球蛋白熒光抗體，將玻片置于帶蓋的不透光容器內(nèi)（底部墊以濾紙，紙上放玻片架，加適量水使濾紙浸濕，玻片數(shù)量少時(shí)可用平皿，內(nèi)置2-3個(gè)浸濕的棉球），密蓋，放置于37°C染色30min（溫度和時(shí)間根據(jù)標(biāo)本情況而定）。
7、取出玻片，置玻片架上，先以PBS沖去未結(jié)合的標(biāo)記抗體液，然后置大量PBS中漂洗15min，或直接在中性或偏堿性的自來(lái)水下沖洗5min，然后浸泡于PBS中1min。
8、取出玻片，用濾紙吸去多余水分，保持標(biāo)本濕潤(rùn)，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋封片后置熒光顯微鏡檢查。
三、結(jié)果記錄
觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度用以下符號(hào)表示：
-：無(wú)熒光；
±：極弱的可疑熒光；
+：熒光較弱，但清楚可見；
++：熒光明顯，呈黃綠色；
+++：熒光明亮，呈明顯的綠色；
++++：熒光閃亮，呈耀眼的亮綠色。
待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上，而各種對(duì)照顯示為（±）或（-），即可判定為陽(yáng)性。
四、注意事項(xiàng)
1、應(yīng)設(shè)立對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以排除非特異性熒光。
2、用熒光顯微鏡檢查標(biāo)本時(shí)，每次檢查時(shí)間以1h為宜，超過(guò)1.5h，高壓汞燈的亮度會(huì)逐漸下降，熒光減弱。此外，標(biāo)本受紫外線照射15min后，熒光明顯減弱，可能是熒光色素與抗體發(fā)生暫時(shí)解離所致，所以最多不得超過(guò)2-3h。
3、熒光顯微鏡的光源壽命有限，通常只有200h，反復(fù)開閉更能影響其壽命，幫標(biāo)本應(yīng)集中檢查，節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。燈熄后再用時(shí)，須待燈光冷卻后才能再開。
4、標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，熒光會(huì)逐漸減弱，若將標(biāo)本放在4°C 保存，可延長(zhǎng)熒光時(shí)間。