培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)常見(jiàn)的問(wèn)題和解決方法！
中國(guó)微生物菌種查詢(xún)網(wǎng) / 2018-11-01 11:17:09
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一：培養(yǎng)細(xì)胞死亡
可能原因
（1）培養(yǎng)箱內(nèi)無(wú)CO 2
（2）培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大
（3）細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過(guò)程中損傷
（4）培養(yǎng)液滲透壓不正確
（5）培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積
（6）更多原因參考問(wèn)題4和問(wèn)題7
建議解決方法
（1）檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)CO 2
（2）檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度
（3）取新的保存細(xì)胞種
（4）檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓。注意：大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能耐受滲透壓為260 – 350 mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。
（5）換入新鮮培養(yǎng)液
二：培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁
可能原因
（1）胰蛋白酶消化過(guò)度
（2）支原體污染
（3）培養(yǎng)瓶瓶底不干凈
（4）培養(yǎng)液pH值過(guò)堿（NaHCO 3 分解）
（5）消化液或培養(yǎng)液配制錯(cuò)誤、過(guò)期儲(chǔ)存、儲(chǔ)存不當(dāng)
（6）細(xì)胞老化（如傳代前細(xì)胞已匯合導(dǎo)致失去貼附性）
（7）接種細(xì)胞起始濃度太低或太高
建議解決方法
（1）縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度。
（2）分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
（3）注意刷洗，或換用一次性塑料培養(yǎng)瓶
（4）使用無(wú)菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無(wú)菌CO 2 （將培養(yǎng)液敞口放入培養(yǎng)箱也可）
（5）重新配置消化液或培養(yǎng)液
（6）啟用新的保種細(xì)胞
（7）調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度
三：懸浮細(xì)胞成簇
可能原因
（1）培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子
（2）支原體污染
（3）蛋白酶過(guò)度消化使得細(xì)胞裂解釋
（4）DNA污染
建議解決方法
（1）用無(wú)鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕輕吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液。
（2）分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
（3）用DNase I 處理細(xì)胞。
四：原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染
可能原因
原代培養(yǎng)組織在進(jìn)入培養(yǎng)前已污染
建議解決方法
培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織。
五：培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢
可能原因
細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題、可能原因及解決方法
（1）由于更換不同培養(yǎng)液或血清
（2）培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子耗盡或缺乏或已被破壞。
（3）培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染
（4）試劑保存不當(dāng)
（5）接種細(xì)胞起始濃度太低
（6）細(xì)胞已老化
（7）支原體污染
建議解決方法
（1）比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。
（2）換入新鮮配制培養(yǎng)液，或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長(zhǎng)因子。
（3）用無(wú)抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物?；蛴每股爻?。
（4）血清需保存在-5℃ 到-20℃。培養(yǎng)液需在2－8℃避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2 周內(nèi)用完。
（5）增加接種細(xì)胞起始濃度。
（6）換用新的保種細(xì)胞。
（7）分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
六：培養(yǎng)液pH 值變化太快
可能原因
（1）CO 2 張力不對(duì)
（2）培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊
（3）NaHCO 3 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足
（4）培養(yǎng)液中鹽濃度不正確
（5）細(xì)菌、酵母或真菌污染
建議解決方法
（1）按培養(yǎng)液中NaHCO 3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO 2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO 3 對(duì)應(yīng)CO 2 濃度為5％ 到10％。
（2）松開(kāi)瓶蓋1/4 圈。
（3）改用不依賴(lài)CO 2 培養(yǎng)液。加HEPES 緩沖液至10 到25mM 終濃度。
（4）在CO 2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。
（5）丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。
七：培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變
可能原因
（1）洗滌劑清洗后殘留有磷酸鹽，將培養(yǎng)基成分沉淀下來(lái)
（2）冰凍保存培養(yǎng)液
建議解決方法
（1）用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后滅菌。
（2）將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動(dòng)使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。
問(wèn)題3：培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀， 同時(shí)pH 發(fā)生變化
可能原因
細(xì)菌或真菌污染
建議解決方法
丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。