細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)不僅對(duì)疾病的病原學(xué)診斷有重要價(jià)值，同時(shí)對(duì)臨床治療的藥物選擇也具有十分重要意義。
一、生物學(xué)性狀
肺炎鏈球菌革蘭染色呈陽(yáng)性。球形或矛頭狀，成雙排列，少呈鏈狀。在組織中可形成莢膜（人工培養(yǎng)莢膜逐漸消失），無(wú)鞭毛及芽孢。
2. 培養(yǎng)特點(diǎn)
（1） 培養(yǎng)基
肺炎鏈球菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，需采用質(zhì)量好的哥倫比亞瓊脂基礎(chǔ)和新鮮血液（ 5％馬血或羊血） 。
瓊脂濃度可適當(dāng)下降至1％～1.2％，有利于肺炎鏈球菌的生長(zhǎng)。
1）標(biāo)本處理
及時(shí)將采集標(biāo)本接種到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上是提高分離率的前提。因?yàn)?，肺炎鏈球菌?duì)干燥、對(duì)寒冷的抵抗力均較弱，在標(biāo)本離開(kāi)機(jī)體暴露于外界復(fù)雜的環(huán)境中，其存活率十分低，不及時(shí)接種適當(dāng)培養(yǎng)基是導(dǎo)致分離率低的主要原因。
2）選擇性分離培養(yǎng)基
培養(yǎng)基中添加5μg/ml慶大霉素有利于肺炎鏈球菌的分離。
3)培養(yǎng)環(huán)境
5～10％CO2、35℃培養(yǎng)24～48h。
（3）肺炎鏈球菌的菌落形態(tài)
在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，肺炎鏈球菌形成扁平、中間有凹陷的典型菌落，少數(shù)菌可呈粘液型菌落。
3.抗原結(jié)構(gòu)
（1）種屬特異性抗原：為菌體多糖抗原，存在于肺炎鏈球菌的細(xì)胞壁。
（2）型特異性抗原：是存在于肺炎鏈球菌莢膜中的一種多糖多聚體，可溶于水，據(jù)此抗原可將肺炎鏈球菌分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等個(gè)型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最強(qiáng)。
（3）菌體核蛋白抗原：存在于菌體深部，為蛋白質(zhì)，無(wú)特異性。
二、肺炎鏈球菌鑒定
肺炎鏈球菌的鑒定，主要應(yīng)與甲型溶血性鏈球菌鑒別。其中以膽汁溶菌試驗(yàn)、菊糖發(fā)酵和optochin試驗(yàn)最為常用。必要時(shí)可作小鼠毒力試驗(yàn)加以鑒別。在上述試驗(yàn)中，肺炎鏈球菌均應(yīng)陽(yáng)性，而甲型溶血性鏈球菌為陰性。必要時(shí)可用特異性單克隆乳膠或自動(dòng)化儀器等相應(yīng)鑒定卡作鑒定。
1. 溶血性檢查
肺炎鏈球菌在厭氧或二氧化碳環(huán)境中溶血能力大大加強(qiáng)，草綠色溶血環(huán)很大，可與其他草綠色鏈球菌相區(qū)別。
2. Optochin(OP)敏感試驗(yàn)
optochin即乙基氫化叩卟啉，因結(jié)構(gòu)似于奎寧，故又稱(chēng)為乙基氫化羥基奎寧。該藥對(duì)肺炎鏈球菌的作用機(jī)制是干擾其葉酸的合成。
optochin敏感試驗(yàn)方法似藥敏試驗(yàn)。挑取被檢菌，密涂于血平板上，貼上含5μg/片的optochin紙片，置5~10%CO2的大氣中（或燭缸），35℃孵育過(guò)夜。抑菌環(huán)直徑>=14mm為敏感，推斷為肺炎鏈球菌。抑菌環(huán)直徑<14mm時(shí)參照膽汁溶菌試驗(yàn)。肺炎鏈球菌的抑制圈直徑常在20mm以上，甲型溶血性鏈球菌（約98%）小于12mm。
也有例外，我們?cè)趯?shí)際工作中檢出過(guò)耐optochin的肺炎鏈球菌，并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的緩癥鏈球菌和部分口腔鏈球菌對(duì)optochin的抑菌環(huán)直徑>=14mm。應(yīng)注意鑒別。
但大多數(shù)肺炎鏈球菌對(duì)苯唑西林（Oxacillin,OX）是敏感的(除外PRP)，而緩癥鏈球菌和口腔鏈球菌對(duì)OX耐藥。這可作為輔助鑒別點(diǎn)。
3. 膽汁溶菌試驗(yàn)
自溶酶是一種L-丙氨酸--N-乙酰胞壁酰胺酶，能切斷肽聚糖上L-丙氨酸與N-乙酰胞壁酸間的連接鍵，從而破壞細(xì)胞壁，使菌溶解。
自溶酶在菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期被激活，也可被膽汁或膽鹽等活性物質(zhì)激活，從而促進(jìn)培養(yǎng)物中的菌體溶解。肺炎鏈球菌膽汁溶菌試驗(yàn)為陽(yáng)性，甲型溶血性鏈球菌的膽汁溶菌試驗(yàn)為陰性。
（1）試管法:
取新鮮培養(yǎng)物分裝于兩支試管內(nèi)（每支1ml），其中一支加入10%的去氧膽酸鈉溶液0.1ml或純牛膽汁0.2ml，另一支加入無(wú)菌鹽水兩滴（對(duì)照），15min后，陽(yáng)性者細(xì)菌被溶解，試管內(nèi)液體呈透明狀，陰性者無(wú)變化。
（2）平皿法:
加一滴10%的去氧膽酸鈉溶液或純牛膽汁于被檢菌菌苔上，15min后，陽(yáng)性者細(xì)菌菌苔被溶解，陰性者無(wú)變化。試驗(yàn)應(yīng)有已知肺炎鏈球菌作陽(yáng)性對(duì)照。
4.乳膠凝集試驗(yàn)
結(jié)果準(zhǔn)確、快速、特異性高。
5. 莢膜腫脹試驗(yàn)
取一滴抗血清與一滴菌懸液混勻，加少量美藍(lán)液混合后加蓋片，室溫10~20min后，用油鏡檢查，如查到菌體呈蘭色，周?chē)@有界限明顯未染色的膨大空白圈為陽(yáng)性?？捎糜诜窝祖溓蚓姆中?。
6. 凝集試驗(yàn)
包括血清凝集試驗(yàn)、SPA（葡萄球菌蛋白A）協(xié)同凝集試驗(yàn)、反向乳膠凝集試驗(yàn)等方法。
三、肺炎鏈球菌的藥敏試驗(yàn)
K-B法：采用Mueller-Hinton瓊脂＋5％羊血培養(yǎng)基。直接菌落懸液法(0.5麥?zhǔn)蠁挝痪?，?5分鐘內(nèi)接種完)作為接種液。
稀釋法：包括瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法和Etest法。
培養(yǎng)條件：為35℃ 、5％CO2培養(yǎng)20～24小時(shí)。質(zhì)控菌株ATCC 49619。
1.肺炎鏈球菌的耐藥機(jī)制
青霉素G耐藥肺炎鏈球菌（PRP）的耐藥機(jī)制是肺炎鏈球菌有6種青霉素結(jié)合蛋白（PBP）發(fā)生改變，因?yàn)镻BP1a/1b和PBP2a/2x/2b是β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的作用靶位，改變后使PBP與青霉素G的結(jié)合力下降；
青霉素G耐藥肺炎鏈球菌（PRP）始發(fā)現(xiàn)于1967年；
多重耐藥肺炎鏈球菌（MDR）1977年首次在南非爆發(fā)流行。
肺炎鏈球菌對(duì)奎諾酮類(lèi)抗生素的耐藥主要是由該菌產(chǎn)生拓?fù)涿杆隆?br />
肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的耐藥機(jī)制主要為靶位的改變，即核糖體50S亞單位改變所致，由ersB(erythromycin resistance methylase)基因介導(dǎo)，其耐藥表型為MLS，即對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、林可酰胺類(lèi)和鏈陽(yáng)霉素B交叉耐藥。另一耐藥機(jī)制為主動(dòng)外排系統(tǒng)，由mefA基因介導(dǎo)，其耐藥表型為M，即對(duì)14元環(huán)（紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、地紅霉素、氟紅霉素）、15元環(huán)（阿奇霉素）大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)低水平耐藥，而對(duì)16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)（羅他霉素、柱晶白霉素、交沙霉素、麥迪霉素、麥白霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、米歐卡霉素）、林可霉素和鏈陽(yáng)霉素B敏感。
耐青霉素肺炎鏈球菌的傳播主要有兩種途徑:
(1)克隆傳播，是耐藥菌株從一個(gè)國(guó)家或地區(qū)傳播到另一個(gè)國(guó)家或地區(qū)。
(2)基因水平轉(zhuǎn)移，是把耐藥基因轉(zhuǎn)移到敏感菌株中。
過(guò)度使用抗生素是耐藥菌株傳播的危險(xiǎn)因素。一般認(rèn)為在抗生素的壓力選擇下，敏感菌株被殺死，耐藥菌株確能生存下來(lái), 或者其他相關(guān)鏈球菌耐藥的DNA序列通過(guò)基因轉(zhuǎn)移在肺炎鏈球菌之間傳播。
研究發(fā)現(xiàn)證實(shí)兒童鼻咽部存在“隱匿性耐藥克隆株” 。
隨著我國(guó)兒童β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素大量使用, 可以預(yù)計(jì)不久的將來(lái), 不敏感的肺炎鏈球菌將會(huì)急劇增加。
2.耐青霉素肺炎鏈球菌的檢測(cè)
紙片擴(kuò)散法對(duì)β內(nèi)酰胺類(lèi)藥物結(jié)果的準(zhǔn)確性不夠，用1μg/片苯唑西林(OX)篩選肺炎鏈球菌對(duì)青霉素耐藥時(shí)，當(dāng)抑菌環(huán)直徑小于20mm時(shí)，就必須做稀釋法證實(shí)是耐藥。
3.肺炎鏈球菌的藥敏報(bào)告
用1ug/片苯唑西林紙片測(cè)試青霉素敏感性，當(dāng)抑菌環(huán)≥20mm或MIC≤0.06ug/ml可報(bào)告青霉素敏感。并同時(shí)可報(bào)告氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢克羅、頭孢地尼、頭孢吡肟、頭孢他美、頭孢克肟、頭孢噻肟、頭孢丙烯、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢泊肟、頭孢唑肟、亞胺培南、氯碳頭孢和美羅培南敏感而不需要再測(cè)定這些藥的敏感性。
當(dāng)苯唑西林抑菌圈≤19mm時(shí)應(yīng)確定青霉素、頭孢噻肟或頭孢曲松的MICs，因?yàn)橐志h(huán)≤19mm可以發(fā)生在青霉素耐藥、中介或敏感菌株中。
當(dāng)從血液或腦脊液中分離出肺炎鏈球菌，應(yīng)常規(guī)報(bào)告MICs。測(cè)定的藥物應(yīng)包括青霉素、頭孢噻肟或頭孢曲松、美羅培南和萬(wàn)古霉素。
總結(jié)
1. 肺炎鏈球菌寄居于人的上呼吸道中，是條件致病菌；
2.肺炎鏈球菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，在含有新鮮血液的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好；
3.以optochin 試驗(yàn)和膽汁溶菌試驗(yàn)將肺炎鏈球菌與其他α－溶血鏈球菌相區(qū)別；
4. 血清學(xué)鑒定特異性高；
5. 要注意對(duì)PRP和MDR的檢測(cè)。
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