微生物的種是一個(gè)基本的分類單元,是一大群表性特征高度相似、親緣關(guān)系極其接近、與同屬內(nèi)其他中有著明顯差異的菌株的總稱。
微生物分類鑒定技術(shù)一般分為四個(gè)不同水平:
1. 細(xì)胞的形態(tài)和習(xí)性水平
觀察細(xì)胞的形態(tài)特征、運(yùn)動(dòng)性、酶反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)要求和生長(zhǎng)條件等。
2. 細(xì)胞組分水平
細(xì)胞組成成分例如細(xì)胞壁成分,細(xì)胞氨基酸庫(kù),脂類、醌類、光合色素等的分析。
3. 蛋白質(zhì)水平
氨基酸序列分析、凝膠電泳和各種免疫標(biāo)記技術(shù)
4. 核酸水平
核酸分子雜交,G+C mol%值的測(cè)定,遺傳信息的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo),16S或18S rRNA寡核苷酸序列分析,重要基因序列分析和全基因組測(cè)序等。
針對(duì)不同的微生物,往往要鑒定不同的重點(diǎn)指標(biāo):
霉菌等形體較大的真菌,以形態(tài)特征為主。
放線菌和酵母菌,形態(tài)和生理特征并用。
細(xì)菌,形態(tài)、生理、生化、遺傳等指標(biāo)。
病毒,電子顯微鏡、生化、免疫、致病性。
常見的微生物自動(dòng)/半自動(dòng)鑒定系統(tǒng)主要針對(duì)細(xì)菌及部分真菌設(shè)計(jì)的,均是建立在細(xì)胞的形態(tài)、生理生化水平上的鑒定手段,再利用數(shù)值分類(統(tǒng)計(jì)分類)法進(jìn)行分類。
(1) 比色法(Giles,bioMerieux)
測(cè)定細(xì)菌因分解底物導(dǎo)致 pH 值改變或由于細(xì)菌生長(zhǎng)利用底物而引起的透光度變化; 自動(dòng)將所測(cè)取的數(shù)據(jù)與存儲(chǔ)在硬盤中的菌種資料庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)菌生物模型相比較, 由電腦分析得出的結(jié)果做出鑒定。
(2) 碳源利用法(比色比濁法)(Biolog)
通過(guò)檢測(cè)微生物細(xì)胞利用不同碳源進(jìn)行新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧化還原酶與顯色物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致的顏色變化 (吸光度)以及由于微生物生長(zhǎng)造成的濁度差異,與標(biāo)準(zhǔn)菌數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),即可得出最終結(jié)果。
(3) 酶聯(lián)熒光 (Enzyme Link Fluorescence Assay, ELFA)(bioMerieux miniVIDAS)
樣本中的待檢物由固相捕獲,待檢物再與共扼物結(jié)合,通過(guò)酶(堿性磷酸酶)轉(zhuǎn)化熒光底物,最后由儀器根據(jù)熒光訊號(hào)給出定量或定性結(jié)果(標(biāo)準(zhǔn)曲線) 。
(4) 熒光法(西門子)
在測(cè)試卡的小孔中加入酶底物, 使其與細(xì)菌產(chǎn)生的酶結(jié)合生成熒光物質(zhì)。儀器在較短的時(shí)間內(nèi)能夠分析細(xì)菌對(duì)不同生化底物所產(chǎn)生的發(fā)熒光的物質(zhì), 通過(guò)讀數(shù)器測(cè)定熒光強(qiáng)度來(lái)判定細(xì)菌胞外酶。
(5) 比色熒光法(BD)
以酶為基礎(chǔ)的反應(yīng)底物, 包括顯色底物和熒光底物; 以微生物生長(zhǎng)為基礎(chǔ)的底物是糖類底物和化合物底物, 還有混合底物; 通過(guò)與各種細(xì)菌發(fā)生氧化、降解及水解反應(yīng), 產(chǎn)生顏色的變化或產(chǎn)生熒光物質(zhì),利用顯色和熒光強(qiáng)度的變化來(lái)鑒定細(xì)菌的菌型(經(jīng)典比色改良方法)。
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