引言：
大腸桿菌也稱為大腸埃希氏菌(E.coli)，分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬，革蘭氏陰性無芽孢桿菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無芽孢。能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌，正常棲居條件下不致病。但若進(jìn)入膽囊、膀胱等處可引起炎癥。在腸道中大量繁殖，若在水和食品中檢出此菌，可認(rèn)為是被糞便污染的指標(biāo)，從而可能有腸道病原菌的存在。因此，大腸菌群數(shù)（或大腸菌值）常作為飲水和食物（或藥物）的衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。（國(guó)家規(guī)定，每升飲用水中大腸桿菌數(shù)不應(yīng)超過3個(gè)）該菌對(duì)熱的抵抗力較其他腸道桿菌強(qiáng)，55℃經(jīng)60分鐘或60℃加熱15分鐘仍有部分細(xì)菌存活。在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，在溫度較低的糞便中存活更久。膽鹽、煌綠等對(duì)大腸桿菌有抑制作用。對(duì)磺胺類、鏈霉素、氯霉素等敏感，但易耐藥，是由帶有R因子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而獲得的。
一 、大腸桿菌的危害
近些年，由于食品安全事故層出不窮，受到大腸桿菌污染的食品被食用進(jìn)入人體后，可以引發(fā)痢疾、霍亂或者傷寒等腸道疾病甚至是嚴(yán)重的敗血癥。1982年和1993年在美國(guó)發(fā)生的O157H7大腸桿菌感染性腹瀉的爆發(fā)，就是由于食用了某快餐連鎖店的漢堡包引起的。
二、大腸桿菌的檢測(cè)方法
1 傳統(tǒng)檢測(cè)法
1.1 多管發(fā)酵法(MTF，Multiple－tube fermentation)
多管發(fā)酵法是根據(jù)大腸菌群能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的特征，檢測(cè)水樣中大腸菌群的方法。多管發(fā)酵的大腸菌群陽(yáng)性，如果在 44.5℃的培養(yǎng)基上進(jìn)行 24h的培養(yǎng)，能釋放出熒光產(chǎn)物而使培養(yǎng)基在紫外光源的照射下呈現(xiàn)熒光反應(yīng)，此種方法即可檢測(cè)出樣本中是否含有大腸桿菌，具體步驟:取一定量水樣于乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中進(jìn)行初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)(推測(cè)實(shí)驗(yàn))，再進(jìn)行平板分離(證實(shí)實(shí)驗(yàn))復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)鑒定(完成實(shí)驗(yàn))。根據(jù)各稀釋度發(fā)酵的管數(shù)查最可能數(shù)(mostprobable number，MPN)表，求得每 10mL 或每升水樣中的大腸菌群數(shù) 該法方法簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)的要求和成本低，但是該方法易受其他因素的干擾而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。
1.2 濾膜法(MF，membrane filter)
濾膜法是目前最為流行的檢測(cè)水中大腸桿菌群的方法。濾膜法的具體步驟是首先將一定量的水體樣本注入 0.45μm的濾膜過濾，經(jīng)過抽濾，水中的細(xì)菌則被留在濾膜上，將濾膜貼于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上培養(yǎng) 24h，溫度為恒溫 37℃，這使得菌群因發(fā)酵乳糖而使得濾膜，出現(xiàn)紫紅色，通過計(jì)算濾膜上的菌落進(jìn)而計(jì)算出單位樣 本 中 的 大 腸 桿 菌 的 數(shù) 量。張 淑 蘭 等[1]用ISO9308－1 規(guī)定的濾膜法測(cè)定水中大腸桿菌回收率均值為 94.7% ，批內(nèi)變異系數(shù)小于 0% ，檢出限為500mL 水樣可檢出 1 個(gè) CFU。該方法費(fèi)用較低、原理簡(jiǎn)單、利于推廣，但檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)、步驟繁瑣、干擾因素多，不適于大量樣品的分析，無法滿足污染物品快速檢測(cè)需求。
1.3 平板計(jì)數(shù)法(plate count)
該方法是統(tǒng)計(jì)物品含菌數(shù)的有效方法，操作的順序是首先將樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取定量的稀釋液進(jìn)行培養(yǎng)使其逐漸生長(zhǎng)成肉眼可觀察的菌落，然后通過稀釋度和樣本數(shù)量來計(jì)算菌數(shù)。但是，由于待測(cè)樣品往往不宜完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以，長(zhǎng)成的一個(gè)單菌落也可能來自樣品中的 2～3或更多 個(gè) 細(xì) 胞，因 此 平 板 菌 落 計(jì) 數(shù) 的 結(jié) 果 往 往偏低[2] 。
2 檢測(cè)新技術(shù)
2.1 ATP 生物發(fā)光技術(shù)
ATP 生物發(fā)光技術(shù)是近年來發(fā)展較快的微生物快速檢測(cè)方法。細(xì)胞內(nèi)源性的ATP含量可以反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量和活性。其化學(xué)反應(yīng)如下：ATP+D-Luciferin+O2→Oxyluciferin+AMP+PPi+O2+Light
當(dāng)細(xì)胞受損或死亡時(shí)，其ATP值迅速下降或消失，基于這一原理，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ATP含量，即可反應(yīng)其細(xì)胞的存活狀況。
目前生物熒光反應(yīng)法被廣泛用于食品加工條件的快速評(píng)價(jià)和食品微生物的快速檢測(cè), 同時(shí)在HACCP 管理中也被廣泛用于關(guān)鍵控制點(diǎn)檢測(cè), 與傳統(tǒng)檢測(cè)方法不同之處在于幾分鐘內(nèi)可獲得結(jié)果, 靈敏、快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定是ATP生物發(fā)光的主要優(yōu)勢(shì)，其不足之處是熒光強(qiáng)度（RLU）和菌落形成單位（CFU）之間沒有直接關(guān)系，也無法對(duì)細(xì)菌的種屬進(jìn)行鑒定[3]。
2.2 PCR檢測(cè)技術(shù)
PCR(polymerase chain reaction) 即聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，PCR 是指利用耐熱 DNA 聚合酶的作用,通過變性 - 延伸 - 復(fù)性的循環(huán)操作, 在體外迅速將DNA 模板擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍的一種克隆技術(shù)。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光條帶。
在食品微生物領(lǐng)域中, PCR 用于快速檢測(cè)或鑒定食品中的微生物。已經(jīng)有商業(yè)化的試劑盒。這些實(shí)驗(yàn)在普通的實(shí)驗(yàn)室也可以做, 當(dāng)然, 實(shí)驗(yàn)中存在假陽(yáng)性 ( 即死細(xì)胞) 和假陰性 ( 聚合酶抑制劑或與目標(biāo)微生物的遺傳接近性) 。
2.3 酶底物法
酶底物法已被列為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T4789.32－2002)，用酶底物法來檢測(cè)大腸桿菌的主要原理是:大腸桿菌細(xì)菌能夠產(chǎn)生 β－半乳糖苷酶(β－D－galactosidase)，它能夠分解 ONPG(Ortho－nitro phenyl－β－D－galactopyr－anoside)，從而使得培養(yǎng)基呈現(xiàn)黃色，來檢測(cè)水樣中是否含有大腸桿菌 。利用大腸桿菌內(nèi)源性 β－D－葡糖醛酸糖苷酶(β－D－glucuronidase，GUS)可以將 4－甲基傘形－β－D－葡糖醛 酸 糖 苷 ( 4 － Methylumbelliferyl － － β － D －glucuronidase，MUG)分解為葡萄糖苷、甲基傘形酮，從而形成熒光特異性的產(chǎn)物，在長(zhǎng)波 UV 光為 366nm下可見，并且產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度與大腸桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)正比的關(guān)系，利用所得的線性關(guān)系可定量檢測(cè)食品中的大腸桿菌，但此方法與其他快速檢測(cè)方法相比較而言，耗時(shí)較長(zhǎng)。
展望：
相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，檢測(cè)新技術(shù)具有更高特異性、更高靈敏度、操作方便、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。但大部分微生物快速檢測(cè)技術(shù)還只停留在科學(xué)研究階段，在識(shí)別分辨率及計(jì)數(shù)靈敏度方面還需要進(jìn)一步的改進(jìn)和完善。隨著對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)速度和精確度要求的不斷提高, 相信會(huì)有更有效的檢測(cè)方法, 為人們的生活環(huán)境及安全提供保障。
參考文獻(xiàn)
［1］張淑蘭，韓秀媛，路金爽 .濾膜法測(cè)定水中大腸桿菌簡(jiǎn)便方法的研究［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，1999，11( 4) :231－232.
［2］李子江，鄧鐵娥，蔣受坤 .食品中大腸桿菌兩種測(cè)定方法的比較［J］.疾病監(jiān)測(cè)與控制雜志，2012，6( 8) :491－492.
［3］ 陳盼 賀稚非 龔霄 伍先紹 食品中大腸桿菌快速檢測(cè)方法.食品工程 2007，3(1).
中國(guó)微生物查詢網(wǎng)（family998.com）轉(zhuǎn)載自食品實(shí)驗(yàn)室服務(wù)