人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的體外培養(yǎng)方法及具體操作規(guī)程！
小楊 / 2026-02-06 09:12:28
人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的體外培養(yǎng)方法，根據(jù)細胞來源和培養(yǎng)目的，主要分為原代培養(yǎng)、永生化細胞系培養(yǎng)和干細胞誘導分化培養(yǎng)三大類。以下是詳細的方法學總結(jié)：
一、原代人 RPE 細胞培養(yǎng) (Primary hRPE Culture)
從人眼球（供體眼）中直接分離，最接近體內(nèi)生理狀態(tài)，但操作復雜、產(chǎn)量有限。
1、組織分離與消化法
取材：獲取人眼球，在無菌條件下剝離視網(wǎng)膜，小心分離色素上皮層。
消化：
酶消化法（常用）：使用含膠原酶 IV、分散酶（Dispase）或胰蛋白酶 - EDTA的消化液，37℃消化，將 RPE 細胞從 Bruch 膜上解離。
機械分離法：用細胞刷輕輕刷下 RPE 片，減少酶損傷。
過濾與離心：終止消化，過濾去除組織塊，離心收集細胞沉淀。
2、接種與培養(yǎng)
培養(yǎng)基：常用 DMEM/F12 基礎培養(yǎng)基，添加 10%-20% FBS、雙抗、谷氨酰胺，部分配方添加牛視網(wǎng)膜提取物、氫化可的松或視黃酸以促進分化。
基質(zhì)包被：RPE 細胞貼壁性差，培養(yǎng)皿/瓶需預先用 Matrigel、纖連蛋白或多聚賴氨酸包被。
培養(yǎng)條件：37℃，5% CO?，飽和濕度。
3、純化與傳代
純化：利用 RPE 富含黑色素、呈色素狀的特點，在顯微鏡下手動剔除雜細胞（成纖維細胞）；或利用差速貼壁法。
傳代：原代 RPE 增殖能力弱，通常傳代次數(shù)有限（P0-P3），超過后易失去色素和特異性功能。
二、永生化 RPE 細胞系培養(yǎng) (Immortalized Cell Line)
最常用、最便捷的模型，適合大規(guī)模實驗和藥物篩選。
代表細胞系：ARPE-19
特點：人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系，自發(fā)永生化，無致瘤性，可無限傳代。
培養(yǎng)方法：
培養(yǎng)基：DMEM/F12 + 10% FBS + 雙抗。
培養(yǎng)條件：37℃，5% CO?。
傳代：細胞融合度達 80%-90% 時，用胰酶消化傳代，比例通常為 1:3 至 1:5。
注意：普通培養(yǎng)下 ARPE-19 色素較少，需在特定分化培養(yǎng)基（低血清、添加特定因子）中長期培養(yǎng)才能誘導出色素沉著和緊密連接。
三、干細胞定向分化培養(yǎng) (Stem Cell-Derived RPE)
利用人多能干細胞（hESC 或 iPSC）誘導分化，是再生醫(yī)學和疾病建模的金標準。
1、分化原理
利用視網(wǎng)膜發(fā)育的信號通路，通過調(diào)控 Wnt、Nodal、TGF-β 等通路，將干細胞定向誘導為神經(jīng)視網(wǎng)膜前體細胞，最終成熟為 RPE。
2、典型步驟（自發(fā)分化/定向誘導法）
擬胚體（EB）形成：將干細胞聚集成 EB 懸浮培養(yǎng)。
神經(jīng)誘導：去除飼養(yǎng)層，在無血清培養(yǎng)基中自發(fā)向神經(jīng)外胚層分化。
RPE 篩選：培養(yǎng)數(shù)周后，出現(xiàn)黑褐色、六角形鋪路石樣的色素上皮細胞群落，手動挑取或酶消化純化。
擴增與成熟：將純化的 RPE 在特定培養(yǎng)基中擴增，進一步成熟，形成具有極性和緊密連接的單層。
3、優(yōu)勢
來源無限，可獲得大量均一細胞。
可構(gòu)建患者特異性 iPSC-RPE，用于遺傳病研究。
四、特殊培養(yǎng)技術(shù)：極性化/3D 培養(yǎng)
為了模擬體內(nèi) RPE 的單層極化結(jié)構(gòu)（頂端 - 基底極性），常采用以下方法：
Transwell 小室培養(yǎng)：
將細胞接種在半透膜上，細胞會自發(fā)形成極性，頂端微絨毛朝向上室（相當于視網(wǎng)膜下腔），基底側(cè)朝向下室（相當于脈絡膜側(cè)）。
常用于研究物質(zhì)轉(zhuǎn)運、吞噬功能和屏障完整性（TEER 測量）。
氣 - 液界面培養(yǎng)（ALI）：
上室保持干燥，僅下室加液，促進細胞更好地分化和極化。
五、三種方法對比總結(jié)
方法 優(yōu)點 缺點 主要應用
原代培養(yǎng) 生理功能最真實，色素豐富 取材困難，增殖弱，易污染，個體差異大 機制研究，功能驗證
永生化系 易培養(yǎng)，增殖快，成本低 表型不完全，需誘導才成熟 藥物篩選，基礎實驗，轉(zhuǎn)染
干細胞分化 來源無限，可患者定制，功能成熟 周期長（數(shù)月），技術(shù)要求高 細胞治療，疾病模型，毒性測試
六、培養(yǎng)關鍵注意事項
基質(zhì)：必須包被（Matrigel/Fibronectin），否則難以貼壁。
鑒別：RPE 典型形態(tài)為六角形、鋪路石樣、富含黑色素顆粒。
標志物：鑒定需檢測 RPE65、CRALBP、MITF、ZO-1 等。
氧化應激：RPE 對氧化敏感，避免反復凍融和過度胰酶消化。
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