濾膜法的核心原理與操作步驟及注意事項(xiàng)與質(zhì)控要點(diǎn)！
小楊 / 2025-12-24 10:13:58
百歐博偉生物：濾膜法是低菌含量液體樣品（如飲用水、純凈水、礦泉水）菌落總數(shù)檢測(cè)的核心方法，核心優(yōu)勢(shì)是通過濃縮大量樣品提高檢出靈敏度，以下是結(jié)構(gòu)化的操作步驟、注意事項(xiàng)及質(zhì)控要點(diǎn)：
一、核心原理
用孔徑 0.45μm 的濾膜截留樣品中的細(xì)菌，將濾膜貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面培養(yǎng)，細(xì)菌在濾膜上生長(zhǎng)形成可見菌落，通過計(jì)數(shù)菌落數(shù)換算單位體積樣品的菌落總數(shù)（CFU/mL）。
二、操作步驟（以水樣檢測(cè)為例，參考 GB 5749-2022）
1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
器材滅菌：濾膜（0.45μm，直徑 47mm）、過濾裝置（濾杯、濾座、抽濾瓶）、鑷子、移液管、培養(yǎng)皿等，121℃高壓蒸汽滅菌 20min，冷卻后備用。
培養(yǎng)基制備：配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂，滅菌后傾注平板（每皿約 20mL），凝固后倒置備用（避免表面冷凝水影響）。
樣品預(yù)處理：
清澈水樣：直接取樣，無需處理；
渾濁/含少量懸浮物水樣：可先低速離心（3000r/min，5min）取上清，或用無菌紗布過濾去除大顆粒；
酸性/堿性水樣：用無菌 NaOH 或 HCl 調(diào)節(jié) pH 至 7.0±0.2。
2、過濾操作
組裝過濾裝置，連接抽濾泵，用無菌操作打開濾杯，用無菌鑷子夾取一張濾膜（毛面朝上，光滑面朝下，避免菌落生長(zhǎng)在濾膜背面難以觀察），平鋪在濾座上，壓緊濾杯。
準(zhǔn)確吸取適量樣品（低菌水樣取 100mL，菌含量稍高可取 10~50mL，確保最終菌落數(shù)在 30~300 CFU 之間），緩慢注入濾杯，開啟抽濾泵，控制負(fù)壓（≤0.05MPa，避免壓力過大損傷細(xì)菌或?yàn)V膜破裂）。
樣品過濾完畢后，用 5~10mL 無菌生理鹽水沖洗濾杯內(nèi)壁 2 次，確保殘留樣品全部過濾。
關(guān)閉抽濾泵，松開濾杯，用無菌鑷子輕輕夾取濾膜（避免折疊或撕裂），平移至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面，用鑷子輕壓濾膜邊緣，使濾膜與瓊脂完全貼合（無氣泡，否則氣泡處細(xì)菌無法生長(zhǎng)）。
3、培養(yǎng)與計(jì)數(shù)
將平板倒置（避免冷凝水滴落污染濾膜），放入 36±1℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 48±2h。
培養(yǎng)結(jié)束后，取出平板，在菌落計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)濾膜上的所有可見菌落（注意區(qū)分菌落與樣品殘留雜質(zhì)，菌落通常有規(guī)則形態(tài)、邊緣清晰，雜質(zhì)無生長(zhǎng)特征）。
結(jié)果計(jì)算：菌落總數(shù)（CFU/mL）= 濾膜上菌落數(shù) ÷ 樣品過濾體積（mL）。若同時(shí)做多個(gè)稀釋度，取 30~300 CFU 的濾膜計(jì)數(shù)，結(jié)果取平均值。
三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)（含常見問題與解決辦法）
1、濾膜選擇與使用
必須使用0.45μm 孔徑濾膜（截留細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)孔徑），避免用 0.22μm 濾膜（孔徑過小，易堵塞且可能截留營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）；
濾膜需無破損、無裂紋，滅菌后檢查完整性（可通過過濾無菌水后培養(yǎng)，確認(rèn)無雜菌生長(zhǎng)）；
夾取濾膜時(shí)戴無菌手套，避免手上細(xì)菌污染，且只能夾取濾膜邊緣（避免觸碰有效過濾區(qū)域）。
2、過濾過程控制
負(fù)壓控制：負(fù)壓過大（>0.05MPa）會(huì)導(dǎo)致濾膜破裂、細(xì)菌細(xì)胞受損，負(fù)壓過小則過濾速度慢、效率低；
避免樣品溢出：注入樣品時(shí)沿濾杯內(nèi)壁緩慢倒入，防止樣品濺出污染濾膜邊緣或?qū)嶒?yàn)臺(tái)；
沖洗步驟不可?。哼^濾后用無菌生理鹽水沖洗濾杯，可減少樣品殘留，避免菌落聚集在濾杯邊緣未被截留。
3、濾膜與瓊脂貼合
必須確保濾膜與瓊脂無氣泡：若有氣泡，氣泡區(qū)域的細(xì)菌無法接觸瓊脂營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致計(jì)數(shù)偏低；
濾膜不可折疊：折疊會(huì)導(dǎo)致菌落重疊，難以區(qū)分計(jì)數(shù)，若不慎折疊需更換濾膜重新操作。
4、樣品處理與干擾排除
渾濁樣品處理：懸浮物過多會(huì)堵塞濾膜，可通過離心、紗布過濾預(yù)處理，或減少單次過濾體積（如從 100mL 減至 50mL）；
化學(xué)干擾：含消毒劑、防腐劑的樣品，需先做中和處理，否則細(xì)菌會(huì)被抑制無法生長(zhǎng)；
pH 調(diào)節(jié)：樣品 pH<6 或> 8 時(shí)，需調(diào)節(jié)至 7.0±0.2，否則會(huì)影響瓊脂凝固和細(xì)菌生長(zhǎng)。
5、質(zhì)控要點(diǎn)（確保結(jié)果準(zhǔn)確）
空白對(duì)照：每批實(shí)驗(yàn)設(shè)置“無菌水空白對(duì)照”（取 100mL 無菌水按相同步驟過濾培養(yǎng)），空白平板菌落數(shù)應(yīng)≤1 CFU，否則說明實(shí)驗(yàn)器材或操作存在污染；
平行樣：每個(gè)樣品至少做 2 個(gè)平行樣，平行樣菌落數(shù)差值應(yīng)≤10%，否則需重新檢測(cè)；
菌落計(jì)數(shù)：若濾膜上菌落過于密集（>300 CFU），需稀釋樣品后重新過濾（如將樣品稀釋 10 倍后取 100mL 過濾）；若菌落數(shù) < 30 CFU，可增加過濾體積（如取 200mL 水樣過濾）或降低稀釋倍數(shù)。
6、常見問題與解決辦法
常見問題 可能原因 解決辦法
濾膜破裂 負(fù)壓過大、濾膜本身有破損、夾取時(shí)用力過猛 控制負(fù)壓≤0.05MPa，滅菌前檢查濾膜完整性，輕柔夾取
濾膜堵塞，過濾速度極慢 樣品懸浮物過多、濾膜孔徑選擇不當(dāng) 預(yù)處理樣品（離心/紗布過濾），更換新濾膜，減少單次過濾體積
空白平板有雜菌 器材滅菌不徹底、操作過程污染 重新滅菌器材，規(guī)范無菌操作，戴手套、口罩，避免實(shí)驗(yàn)臺(tái)污染
菌落數(shù)為 0，但樣品可能含菌 樣品含消毒劑、pH 不當(dāng)、濾膜貼合有氣泡 中和樣品中的消毒劑，調(diào)節(jié) pH 至 7.0±0.2，重新操作確保濾膜無氣泡
菌落聚集難以計(jì)數(shù) 樣品未搖勻、過濾時(shí)菌液未分散均勻 取樣前充分搖勻樣品，過濾時(shí)緩慢注入，避免菌液集中在濾膜某一區(qū)域
四、適用場(chǎng)景與結(jié)果判定
適用樣品：飲用水、礦泉水、純凈水、高純度試劑水等低菌含量液體樣品（菌含量通常≤100 CFU/mL）；
結(jié)果判定：
濾膜上菌落形態(tài)清晰、邊緣整齊，可直接計(jì)數(shù)；
若出現(xiàn)蔓延菌落（菌落融合成片），需重新檢測(cè)（可能是濾膜貼合不緊密或樣品菌含量過高）；
結(jié)果報(bào)告需注明“濾膜法”及樣品過濾體積，如“10 CFU/100mL（濾膜法）”。
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