細(xì)胞傳代操作指南：實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備、操作步驟及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-12-23 10:55:04
一、耗材及試劑
需準(zhǔn)備：
無菌器具：干凈滅菌的培養(yǎng)皿、50mL 離心管、15mL 離心管、1mL 槍頭、1mL 移液器、鑷子、馬克筆
試劑：細(xì)胞適配的培養(yǎng)液、血清、胰酶、雙抗（青霉素 + 鏈霉素）、無菌 1×PBS
二、注意事項(xiàng)
1、所有進(jìn)入超凈臺(tái)的物品、器具（包括手部），都需噴灑 75% 酒精消毒；
2、超凈臺(tái)內(nèi)操作時(shí)，手部不可從敞開的培養(yǎng)皿、管口、瓶口、槍頭盒上方經(jīng)過（避免手臂帶菌污染）；
3、擰開的管蓋、瓶蓋、培養(yǎng)皿蓋，需正扣在臺(tái)面，嚴(yán)禁倒扣。
三、操作原理
1、細(xì)胞貼壁原因：貼壁細(xì)胞會(huì)分泌細(xì)胞外基質(zhì)（蛋白、多糖等成分），黏附在特殊處理的培養(yǎng)皿/瓶底部；未貼壁時(shí)細(xì)胞呈球形，貼壁后會(huì)伸展為上皮樣或成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。
2、胰酶的解離作用：胰蛋白酶是絲氨酸水解酶，可切斷多肽鏈中賴氨酸、精氨酸殘基的羧基側(cè)肽鍵，水解細(xì)胞間蛋白質(zhì)，使貼壁細(xì)胞從器皿底部脫落分離。
3、消化后細(xì)胞變球形的原因：細(xì)胞自身骨架張力 + 培養(yǎng)液表面張力共同作用，使消化后的細(xì)胞恢復(fù)球形，鏡下觀察呈圓形。
4、胰酶的最佳條件：37℃、pH=8 時(shí)活性最強(qiáng)，因此消化需放入孵箱；通常用 0.25% 胰蛋白酶 + 0.02% EDTA（鈣離子螯合劑）增強(qiáng)消化效果。
5、血清終止消化的原理：血清含有的蛋白可與胰酶結(jié)合，競爭性抑制胰酶活性，從而終止消化。
四、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
進(jìn)入細(xì)胞房要求
穿專用實(shí)驗(yàn)服、拖鞋，戴好手套、口罩，保證進(jìn)入超凈臺(tái)時(shí)無皮膚裸露。
觀察細(xì)胞狀態(tài)
孵箱取細(xì)胞前，手部噴 75% 酒精消毒；取出細(xì)胞后立即關(guān)閉孵箱（避免孵箱溫濕度、CO?濃度波動(dòng)）；
顯微鏡下觀察細(xì)胞，密度長至 90% 左右即可傳代；觀察后將細(xì)胞放回孵箱，避免長時(shí)間暴露。
前期準(zhǔn)備工作（提前 20min 開始）
1、槍頭盒噴 75% 酒精后放入超凈臺(tái)，打開盒蓋（手勿經(jīng)過盒上方），開啟紫外照射超凈臺(tái) + 槍頭；
2、將培養(yǎng)液、血清、胰酶從 4℃冰箱取出，放入 37℃水浴鍋預(yù)熱；
3、20min 后關(guān)閉紫外，合上槍頭盒，將實(shí)驗(yàn)用品放入超凈臺(tái)：
用鑷子撕去瓶口封口膜（丟棄）；
用 75% 酒精浸泡的棉花擦拭移液器、槍頭盒、離心管蓋邊緣、培養(yǎng)液瓶蓋邊緣及臺(tái)面；
4、配置含血清的培養(yǎng)液（50mL 離心管中）：
管蓋正扣臺(tái)面，加入 45mL 含雙抗的培養(yǎng)液（雙抗：培養(yǎng)液 = 1:100）；
加入 5mL 血清（常規(guī)比例 10%，脆弱細(xì)胞可加至 20%）；
5、準(zhǔn)備 15mL 離心管：
管蓋、管壁標(biāo)注細(xì)胞信息；
加入 4mL 含血清的培養(yǎng)液（用于終止消化），擰緊蓋備用。
五、細(xì)胞傳代操作步驟
1、孵箱取細(xì)胞：手部噴酒精后開孵箱，取細(xì)胞后立即關(guān)孵箱，將細(xì)胞放入超凈臺(tái)，再次對(duì)手部消毒后伸入超凈臺(tái)；
2、棄舊液 + PBS 潤洗：
培養(yǎng)皿蓋正扣臺(tái)面，棄去原有培養(yǎng)液；
沿培養(yǎng)皿側(cè)壁緩慢加入 1mL 1×PBS（勿直接吹細(xì)胞，避免物理損傷），蓋上皿蓋后輕輕上下晃動(dòng) 10 次左右；
棄去 PBS；
3、加胰酶消化：
沿側(cè)壁加胰酶（10cm 皿加 3mL，5cm 皿加 1.5mL），蓋好皿蓋后放入孵箱；
4、觀察消化狀態(tài)：
每隔 1min 鏡下觀察，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，若大片細(xì)胞移動(dòng)即消化完成；禁止過度消化（避免細(xì)胞狀態(tài)變差，勿消化至出現(xiàn)白色絮狀物）；
5、終止消化 + 離心：
將培養(yǎng)皿放回超凈臺(tái)，輕輕吹打使細(xì)胞全部脫落；
將含細(xì)胞的胰酶液轉(zhuǎn)移至提前備好的 15mL 離心管（含血清培養(yǎng)液），終止消化；
200rcf 離心 4min；
6、準(zhǔn)備新培養(yǎng)皿：
取新培養(yǎng)皿，在皿蓋上標(biāo)注細(xì)胞信息（名稱、代數(shù)、培養(yǎng)人、傳代日期、傳代比例）；
7、傳代比例選擇：
根據(jù)細(xì)胞生長速度決定（例：1 傳 4 的細(xì)胞，取 1/4 消化后的細(xì)胞接種，3 天可長至 90% 密度）；
8、加培養(yǎng)液至新皿：
10cm 新皿中加入 9mL 含 10% 血清的培養(yǎng)液（后續(xù)加 1mL 細(xì)胞懸液，補(bǔ)足至 10mL 培養(yǎng)體系）；
9、重懸細(xì)胞：
離心后棄上清，加入 4mL 含 10% 血清的培養(yǎng)液，輕輕重懸細(xì)胞至單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)（可鏡下確認(rèn)分散度）；
10、接種 + 孵育：
按傳代比例取對(duì)應(yīng)體積的細(xì)胞懸液，加入新培養(yǎng)皿；
劃“十”字或“米”字 7-10 次混勻細(xì)胞，將培養(yǎng)皿放入孵箱培養(yǎng)。
常用器皿的試劑用量參考
胞傳代｜手把手教你養(yǎng)細(xì)胞1.png)
胞傳代｜手把手教你養(yǎng)細(xì)胞2.png)
胞傳代｜手把手教你養(yǎng)細(xì)胞3.png)
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