乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基實驗操作流程：制備、接種、培養(yǎng)及觀察！
小楊 / 2025-12-10 10:00:00
乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基的實驗核心目標是通過標準化操作制備合格培養(yǎng)基，采用穿刺接種法檢測微生物的運動能力及乳糖發(fā)酵特性，流程分為「培養(yǎng)基制備→滅菌→接種→培養(yǎng)→結(jié)果觀察」5 個關(guān)鍵階段，每個步驟需嚴格控制無菌操作和參數(shù)一致性，避免實驗誤差。
一、實驗前準備
1、試劑與耗材
試劑：蛋白胨（10g/L）、乳糖（10g/L）、瓊脂（3-5g/L）、酚紅指示劑（0.01g/L）、氯化鈉（5g/L，可選）、蒸餾水（1000mL）；
耗材：三角燒瓶（250mL 或 500mL）、試管（15mm×150mm）、硅膠塞/棉塞、無菌接種針、酒精燈、試管架、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱；
樣本：待鑒定微生物純培養(yǎng)物（如細菌菌落）、陽性對照（
大腸桿菌）、陰性對照（
傷寒沙門氏菌）。
2、環(huán)境與儀器準備
無菌操作臺：紫外線照射 30 分鐘消毒，通風后使用；
高壓蒸汽滅菌鍋：提前檢查水位、密封圈，預熱至待機狀態(tài)；
恒溫培養(yǎng)箱：設定 37℃（腸道菌最適溫度），提前預熱。
二、核心操作步驟（詳細流程）
階段 1：乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基制備（1L 配方為例）
步驟 1：稱量與溶解
按配方精準稱量各成分：蛋白胨 10g、乳糖 10g、瓊脂 3-5g、氯化鈉 5g（可選），放入三角燒瓶中；
加入 1000mL 蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻，使固體成分充分分散；
置于酒精燈火焰上緩慢加熱（或用電熱板），邊加熱邊攪拌，直至瓊脂完全融化（培養(yǎng)基呈透明澄清狀，無顆粒沉淀）；
注意：避免大火煮沸導致乳糖焦化（出現(xiàn)棕色沉淀），融化后若有少量雜質(zhì)，可過濾后再分裝。
步驟 2：調(diào)節(jié) pH 與加入指示劑
待培養(yǎng)基冷卻至 50-60℃（不燙手），用 pH 計或精密 pH 試紙檢測 pH，需調(diào)節(jié)至 7.4-7.6（中性偏堿，符合腸道菌生長需求）；
調(diào)節(jié)方法：pH 偏低（<7.4）加少量 1mol/L NaOH 溶液，pH 偏高（>7.6）加少量 1mol/L HCl 溶液，攪拌后重新檢測；
加入 0.01g 酚紅指示劑（或提前配制成 1% 酚紅母液，加入 1mL），攪拌均勻，此時培養(yǎng)基呈紅色透明狀。
步驟 3：分裝與加塞
用移液管或漏斗將融化的培養(yǎng)基分裝至試管中，每管分裝量為試管高度的 1/3（約 5-7mL），避免分裝過多導致穿刺困難；
試管口塞緊硅膠塞或棉塞（棉塞需松緊適度，既能透氣又能防污染），將試管傾斜放置（便于后續(xù)凝固后形成均勻的半固體狀態(tài)）。
階段 2：滅菌（關(guān)鍵環(huán)節(jié)，防污染 + 保成分穩(wěn)定）
將分裝好的試管放入高壓蒸汽滅菌鍋的滅菌籃中，試管之間留有間隙，避免擠壓；
關(guān)閉滅菌鍋蓋，擰緊螺栓，排出鍋內(nèi)冷空氣（冷空氣未排盡會導致滅菌溫度不足）：
打開排氣閥，加熱至蒸汽連續(xù)排出（無白霧），維持 3-5 分鐘后關(guān)閉排氣閥；
設定滅菌參數(shù)：121℃、15psi（1.05kg/cm²），滅菌 15 分鐘；
注意：滅菌時間過長（>20 分鐘）會導致乳糖分解、瓊脂凝固能力下降，過短則無法徹底滅菌。
滅菌結(jié)束后，自然降壓至 0MPa，緩慢打開排氣閥，取出試管，立即直立放置在試管架上，室溫冷卻至凝固（約 2-4 小時，凝固后培養(yǎng)基呈紅色半固體狀，質(zhì)地均勻無氣泡）。
階段 3：穿刺接種（無菌操作 + 規(guī)范穿刺，避免假陽性）
步驟 1：無菌操作準備
點燃酒精燈，將接種針在火焰上灼燒滅菌（從針柄到針尖全程灼燒，針尖需燒至紅熱，冷卻 30 秒后使用，避免燙傷微生物）；
待接種的試管、對照菌株試管在無菌操作臺上打開棉塞/硅膠塞（打開后塞子倒置在臺面，避免污染）。
步驟 2：穿刺接種操作
用滅菌冷卻后的接種針蘸取少量待鑒定微生物純培養(yǎng)物（僅蘸取針尖大小的菌落，避免接種量過多導致擴散模糊）；
手持接種針垂直刺入半固體培養(yǎng)基中心，穿刺深度為培養(yǎng)基高度的 2/3（不可穿到底部，避免接觸試管底部導致污染）；
沿原穿刺路徑輕輕拔出接種針（動作要平穩(wěn)，避免劃破瓊脂表面或側(cè)壁，否則微生物會沿劃痕擴散，形成假陽性“云霧狀”）；
接種后立即塞緊試管塞，在試管壁上標記樣本名稱、接種日期、操作者；
階段 4：恒溫培養(yǎng)
將接種后的試管整齊放入 37℃恒溫培養(yǎng)箱中，直立放置，避免培養(yǎng)基傾斜導致微生物擴散路徑異常；
培養(yǎng)時間：18-24 小時（腸道菌最佳觀察時間），若部分微生物發(fā)酵乳糖較慢，可延長至 48 小時，但需注意避免培養(yǎng)過長導致非運動型微生物因營養(yǎng)擴散出現(xiàn)假陽性。
階段 5：結(jié)果觀察（按指標順序觀察，避免遺漏）
取出培養(yǎng)后的試管，先觀察培養(yǎng)基整體透明度（判斷動力）：
觀察接種線是否清晰，培養(yǎng)基是否呈云霧狀渾濁（運動型微生物），或僅接種點周圍有菌落（非運動型）；
再觀察指示劑顏色變化（判斷乳糖發(fā)酵）：
觀察接種點周圍及整個培養(yǎng)基的顏色，是否由紅色變?yōu)辄S色（產(chǎn)酸）；
最后觀察是否有氣泡或瓊脂斷裂（判斷產(chǎn)氣）：
輕輕晃動試管，觀察半固體培養(yǎng)基中是否有氣泡、裂隙，或瓊脂與試管壁分離（產(chǎn)氣型微生物）；
對照分析：對比陽性對照（
大腸桿菌應呈“云霧狀 + 黃色 + 可能有氣泡”）、陰性對照（
傷寒沙門氏菌應呈“針尖狀菌落 + 紅色 + 無氣泡”），判斷樣本結(jié)果的有效性。
三、關(guān)鍵操作注意事項（避坑指南）
瓊脂濃度控制：必須嚴格按 3-5g/L 配比，濃度過高（>5g/L）會導致培養(yǎng)基過硬，運動型微生物無法擴散；濃度過低（<3g/L）會導致培養(yǎng)基液化，無法維持半固體狀態(tài)；
無菌操作要求：全程在酒精燈火焰附近進行，接種針每次使用前后都需灼燒滅菌，試管塞打開后不可接觸臺面或其他污染物；
穿刺規(guī)范：穿刺必須垂直、深淺一致，同一批次樣本穿刺深度保持統(tǒng)一，否則會因擴散空間不同導致結(jié)果差異；
冷卻與凝固：滅菌后試管需立即直立放置，避免傾斜導致培養(yǎng)基厚度不均；凝固后若培養(yǎng)基表面有氣泡，可輕輕敲擊試管，使氣泡上浮破裂；
結(jié)果判斷時機：18-24 小時為最佳觀察時間，超過 48 小時需注意區(qū)分“真實動力擴散”與“營養(yǎng)擴散導致的渾濁”，必要時重新接種驗證。
四、實驗后處理
觀察完畢的試管需進行滅菌處理（121℃、15 分鐘），避免微生物污染環(huán)境；
實驗耗材（如接種針）需再次灼燒滅菌，臺面用 75% 酒精擦拭消毒；
記錄實驗結(jié)果：詳細記錄樣本的動力狀態(tài)（運動型/非運動型）、乳糖發(fā)酵情況（發(fā)酵/非發(fā)酵）、產(chǎn)氣情況（產(chǎn)氣/不產(chǎn)氣），并與對照菌株對比，得出結(jié)論。
五、總結(jié)
乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基實驗的核心操作邏輯是“穩(wěn)定制備→無菌接種→規(guī)范培養(yǎng)→精準觀察”，每個步驟的關(guān)鍵控制點的是：培養(yǎng)基成分配比與滅菌參數(shù)、穿刺操作的垂直性與無菌性、培養(yǎng)條件的一致性。通過嚴格遵循上述步驟，可準確判斷微生物的運動能力和乳糖發(fā)酵特性，為微生物初步鑒定提供可靠依據(jù)。
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