巧克力瓊脂平板的核心原理與制備方法及具體操作步驟！
小楊 / 2025-09-17 10:50:01
巧克力瓊脂平板（Chocolate Agar Plate）是實(shí)驗(yàn)室常用的營(yíng)養(yǎng)豐富型培養(yǎng)基，因加熱處理后血液中的血紅蛋白釋放，使培養(yǎng)基呈巧克力色而得名。它能為營(yíng)養(yǎng)需求苛刻的細(xì)菌（如
腦膜炎球菌、
流感嗜血桿菌等）提供生長(zhǎng)所需的 X 因子（原卟啉）和 V 因子（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD），廣泛用于苛養(yǎng)菌的分離培養(yǎng)。以下是其具體制備方法，操作需遵循無(wú)菌操作規(guī)范，確保培養(yǎng)基無(wú)菌且成分比例準(zhǔn)確。
一、核心原理
巧克力瓊脂的關(guān)鍵是對(duì)脫纖維羊血（或馬血）進(jìn)行加熱處理：通過(guò) 56~58℃的 “溫和加熱”，破壞紅細(xì)胞釋放血紅蛋白（提供 X 因子），同時(shí)使血液中的 V 因子釋放并保持活性（避免高溫破壞 V 因子），最終與基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)瓊脂（如
哥倫比亞瓊脂、
腦心浸液瓊脂）混合，形成適合苛養(yǎng)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。
二、材料準(zhǔn)備
1、基礎(chǔ)成分（以制備 1000mL 培養(yǎng)基為例，可按比例縮放）
成分名稱 用量 作用說(shuō)明
哥倫比亞瓊脂基礎(chǔ) 40~45g 提供碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素等基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)，是培養(yǎng)基的“骨架”
脫纖維羊血（或馬血） 50~100mL 提供 X 因子（血紅蛋白）和 V 因子，需新鮮、無(wú)溶血，避免使用牛血（含 V 因子抑制物）
無(wú)菌蒸餾水（或去離子水） 900~950mL 溶解基礎(chǔ)瓊脂，確保成分均勻分散
2、儀器與耗材
電子天平、pH 計(jì)、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋（精度 ±1℃）
錐形瓶（2000mL，帶棉塞或硅膠塞）、量筒（1000mL）
高壓蒸汽滅菌器（121℃滅菌用）
無(wú)菌培養(yǎng)皿（直徑 90mm，提前滅菌或一次性無(wú)菌）
無(wú)菌移液管（10mL、50mL）、酒精燈、無(wú)菌操作臺(tái)
溫度計(jì)（量程 0~100℃，用于監(jiān)測(cè)加熱溫度）
三、具體制備步驟（分 6 步，核心是“加熱處理血液”和“無(wú)菌倒平板”）
步驟 1：溶解基礎(chǔ)瓊脂，調(diào)整 pH
用電子天平準(zhǔn)確稱取 40~45g 哥倫比亞瓊脂基礎(chǔ)，放入 2000mL 錐形瓶中。
用量筒量取 900~950mL 無(wú)菌蒸餾水，倒入錐形瓶，輕輕搖勻（避免瓊脂粘壁）。
將錐形瓶置于 磁力攪拌器上，60~70℃水浴加熱（或直接用電爐小火加熱，需不斷攪拌），直至瓊脂完全溶解（溶液澄清，無(wú)肉眼可見(jiàn)顆粒）。
用 pH 計(jì)檢測(cè)溶液 pH，需調(diào)整至 7.2~7.4（若 pH 偏低，滴加 1mol/L NaOH；若偏高，滴加 1mol/L HCl，邊加邊攪拌，避免局部過(guò)酸 / 過(guò)堿）。
步驟 2：高壓蒸汽滅菌（殺滅雜菌，避免污染）
向錐形瓶中補(bǔ)加無(wú)菌蒸餾水至 1000mL（加熱溶解過(guò)程中會(huì)有水分蒸發(fā)，需補(bǔ)足體積，確保濃度準(zhǔn)確）。
錐形瓶口塞緊棉塞（或硅膠塞），外包牛皮紙（防止滅菌時(shí)水汽進(jìn)入），放入高壓蒸汽滅菌器。
設(shè)定滅菌參數(shù)：121℃、103.4kPa（1.05kg/cm²）、滅菌 15~20 分鐘（滅菌時(shí)間從達(dá)到設(shè)定溫度開(kāi)始計(jì)時(shí)，避免滅菌不徹底）。
滅菌結(jié)束后，關(guān)閉滅菌器，待壓力降至 0、溫度降至 80~90℃時(shí)，取出錐形瓶，置于無(wú)菌操作臺(tái)旁的水浴鍋中（60~70℃保溫，防止瓊脂凝固，備用）。
步驟 3：血液加熱處理（關(guān)鍵步驟，釋放 X/V 因子）
取出冷藏的 新鮮脫纖維羊血（提前在室溫下放置 10~15 分鐘，避免溫差過(guò)大導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂），用量筒量取 50~100mL，倒入無(wú)菌燒杯中。
將燒杯放入 恒溫水浴鍋，設(shè)定溫度 56~58℃，用溫度計(jì)持續(xù)監(jiān)測(cè)血液溫度（核心：溫度不可超過(guò) 58℃，否則會(huì)破壞 V 因子；不可低于 56℃，否則血紅蛋白釋放不充分）。
加熱過(guò)程中，用無(wú)菌玻璃棒輕輕攪拌血液（避免局部過(guò)熱），觀察血液顏色變化：從鮮紅色逐漸變?yōu)?暗棕色（巧克力色），此過(guò)程約 5~10 分鐘（需持續(xù)監(jiān)測(cè)，避免過(guò)度加熱導(dǎo)致血液凝固）。
達(dá)到巧克力色后，立即將燒杯從水浴鍋中取出，放入 室溫水中冷卻（快速降溫至 45~50℃，防止持續(xù)加熱破壞營(yíng)養(yǎng)成分）。
步驟 4：混合基礎(chǔ)瓊脂與血液（無(wú)菌操作，避免污染）
將保溫在 60~70℃的基礎(chǔ)瓊脂溶液（錐形瓶）轉(zhuǎn)移至無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，待其溫度降至 45~50℃（用手背觸碰錐形瓶外壁，不燙手即可，避免溫度過(guò)高殺死血液中的營(yíng)養(yǎng)成分，或過(guò)低導(dǎo)致瓊脂提前凝固）。
在無(wú)菌操作下，用無(wú)菌移液管吸取 冷卻后的巧克力色血液，緩慢倒入基礎(chǔ)瓊脂溶液中，邊倒邊輕輕搖勻（避免劇烈搖晃產(chǎn)生氣泡，影響平板平整度）。
（可選）若需制備選擇性巧克力瓊脂，此時(shí)可加入抗生素添加劑（如萬(wàn)古霉素 5μg/mL、多粘菌素 B2.5μg/mL），輕輕搖勻（需嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)控制濃度，避免抑制目標(biāo)菌生長(zhǎng)）。
步驟 5：倒平板（均勻分配，避免浪費(fèi)）
在無(wú)菌操作臺(tái)上，取出無(wú)菌培養(yǎng)皿（一次性或滅菌后的），打開(kāi)皿蓋（僅打開(kāi)一條縫隙，避免外界雜菌落入），將混合好的培養(yǎng)基緩慢倒入培養(yǎng)皿中，每皿倒入 15~20mL（厚度約 3~4mm，過(guò)厚影響菌落觀察，過(guò)薄易干裂）。
倒完后，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿（順時(shí)針或逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)），使培養(yǎng)基均勻覆蓋皿底，避免產(chǎn)生氣泡或局部厚薄不均。
蓋上皿蓋，將培養(yǎng)皿平放在無(wú)菌操作臺(tái)上，室溫下靜置 30~60 分鐘（或放入 37℃培養(yǎng)箱中靜置 20 分鐘），待培養(yǎng)基完全凝固（凝固后表面光滑、無(wú)凹陷）。
步驟 6：質(zhì)量檢測(cè)與儲(chǔ)存（確保培養(yǎng)基合格）
無(wú)菌性檢測(cè)：取 1~2 個(gè)制備好的平板，不接種任何菌，放入 35~37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24~48 小時(shí)，若平板表面無(wú)任何菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基無(wú)菌合格；若有菌落，需重新制備。
適用性檢測(cè)：接種標(biāo)準(zhǔn)菌株（如
腦膜炎球菌 ATCC 13090），35~37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 小時(shí)，若菌株生長(zhǎng)良好（菌落呈圓形、光滑、無(wú)色透明），說(shuō)明培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)合格。
儲(chǔ)存：合格的平板需倒置（防止冷凝水滴落污染菌落），放入 4±2℃冰箱中儲(chǔ)存，保質(zhì)期一般為 7~14 天（若添加抗生素，保質(zhì)期縮短至 3~5 天，需標(biāo)注制備日期和失效日期）。
四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)（避免制備失敗的核心要點(diǎn)）
血液選擇：優(yōu)先使用脫纖維羊血，不可用牛血（牛血中含 V 因子抑制物，會(huì)抑制
流感嗜血桿菌、
腦膜炎球菌生長(zhǎng)）；血液需新鮮（采集后 48 小時(shí)內(nèi)使用），無(wú)溶血、無(wú)凝塊。
溫度控制：
血液加熱：嚴(yán)格控制在 56~58℃，溫度過(guò)高會(huì)破壞 V 因子，導(dǎo)致苛養(yǎng)菌無(wú)法生長(zhǎng)；溫度過(guò)低則血紅蛋白釋放不足，培養(yǎng)基顏色偏淺，營(yíng)養(yǎng)不足。
基礎(chǔ)瓊脂與血液混合：基礎(chǔ)瓊脂溫度需降至 45~50℃，過(guò)高會(huì)殺死血液中的營(yíng)養(yǎng)成分，過(guò)低會(huì)導(dǎo)致瓊脂提前凝固，無(wú)法均勻混合。
無(wú)菌操作：從滅菌后到倒平板的全過(guò)程需在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行，避免空氣中的雜菌污染；移液管、培養(yǎng)皿等耗材需提前滅菌，操作時(shí)避免手觸碰皿口和培養(yǎng)基表面。
pH 調(diào)整：pH 需嚴(yán)格控制在 7.2~7.4，過(guò)酸或過(guò)堿會(huì)抑制目標(biāo)菌生長(zhǎng)（如腦膜炎球菌在偏酸性環(huán)境中生長(zhǎng)不良）。
通過(guò)以上步驟，即可制備出營(yíng)養(yǎng)充足、無(wú)菌合格的巧克力瓊脂平板，適用于
腦膜炎球菌、
流感嗜血桿菌等苛養(yǎng)菌的分離、培養(yǎng)和鑒定。
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