酵母菌直接鏡檢計(jì)數(shù)法的核心原理與適用場(chǎng)景及操作步驟！
小楊 / 2025-09-18 09:39:46
酵母菌直接鏡檢計(jì)數(shù)法是通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（或血球計(jì)數(shù)板）在顯微鏡下直接觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量的方法，核心優(yōu)勢(shì)是快速便捷，能在 10-20 分鐘內(nèi)獲得結(jié)果，但計(jì)數(shù)的是活菌與死菌的總和。
一、核心原理與適用場(chǎng)景
該方法利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上固定體積的計(jì)數(shù)室，將稀釋后的酵母菌懸液滴入計(jì)數(shù)室，在顯微鏡下數(shù)出特定區(qū)域的細(xì)胞數(shù)，再通過(guò)公式換算成每毫升樣品中的總細(xì)胞數(shù)。
適用場(chǎng)景：
需快速獲得細(xì)胞數(shù)量的場(chǎng)景（如發(fā)酵過(guò)程中酵母菌增殖速度監(jiān)測(cè)）。
對(duì)計(jì)數(shù)精度要求不高，且無(wú)需區(qū)分活菌與死菌的實(shí)驗(yàn)（若需區(qū)分活菌，需結(jié)合染色法，如美藍(lán)染色）。
樣品中酵母菌濃度較高（通常需≥10? CFU/mL，濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差大）。
二、關(guān)鍵器材準(zhǔn)備
血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：常用規(guī)格有兩種，計(jì)數(shù)室體積均為0.1mm³（即 10?? mL），僅計(jì)數(shù)格數(shù)量不同，后續(xù)計(jì)算公式需對(duì)應(yīng)調(diào)整。
25×16 型：計(jì)數(shù)室分為 25 個(gè)中格，每個(gè)中格又分為 16 個(gè)小格，共 400 個(gè)小格。
16×25 型：計(jì)數(shù)室分為 16 個(gè)中格，每個(gè)中格又分為 25 個(gè)小格，共 400 個(gè)小格。
蓋玻片：需配套血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的專用厚蓋玻片（厚度約 0.17mm），避免因蓋玻片過(guò)薄導(dǎo)致計(jì)數(shù)室體積不準(zhǔn)。
顯微鏡：普通光學(xué)顯微鏡即可，需具備 40 倍物鏡（高倍鏡）和 10 倍目鏡。
稀釋液：根據(jù)樣品特性選擇，常用無(wú)菌生理鹽水（0.85% NaCl 溶液）或無(wú)菌蒸餾水，若樣品含雜質(zhì)，可加入少量亞甲藍(lán)（0.1%）染色，使細(xì)胞更易區(qū)分。
移液器與吸頭：建議使用 10μL 或 20μL 移液器，確保滴加體積準(zhǔn)確。
三、詳細(xì)操作步驟（以 25×16 型計(jì)數(shù)板為例）
1、樣品稀釋：確保計(jì)數(shù)室細(xì)胞數(shù)在合理范圍
若酵母菌濃度過(guò)高（如培養(yǎng)液），需用無(wú)菌稀釋液梯度稀釋，最終目標(biāo)是：滴入計(jì)數(shù)室后，每個(gè)中格的細(xì)胞數(shù)約為 5-10 個(gè)，避免細(xì)胞重疊或過(guò)少導(dǎo)致誤差。
舉例：若預(yù)估樣品濃度為 10? CFU/mL，可稀釋 100 倍（先 1:10 稀釋，再取 1mL 稀釋液加 9mL 稀釋液），使?jié)舛冉抵?10? CFU/mL 左右。
2、計(jì)數(shù)板與蓋玻片處理
用無(wú)水乙醇擦拭計(jì)數(shù)板和蓋玻片，去除殘留雜質(zhì)，然后用鏡頭紙輕輕擦干（避免劃傷計(jì)數(shù)室刻度）。
將蓋玻片放在計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室上方，輕輕按壓，確保蓋玻片與計(jì)數(shù)板之間無(wú)氣泡（若有氣泡需重新放置，否則會(huì)影響細(xì)胞分布）。
3、滴加樣品：控制體積，避免溢出
用移液器吸取 10μL 稀釋后的酵母菌懸液，滴在蓋玻片邊緣（計(jì)數(shù)室與蓋玻片的縫隙處），利用毛細(xì)作用使液體自然滲入計(jì)數(shù)室，直至充滿但不溢出（若溢出，需用吸水紙吸干后重新滴加）。
靜置 5-10 分鐘，讓酵母菌細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)室底部，避免顯微鏡下觀察時(shí)細(xì)胞漂移。
4、顯微鏡觀察與計(jì)數(shù)：遵循“計(jì)上不計(jì)下、計(jì)左不計(jì)右”原則
先將計(jì)數(shù)板放在顯微鏡載物臺(tái)上，用低倍鏡（10 倍物鏡）找到計(jì)數(shù)室的方格線，再切換到高倍鏡（40 倍物鏡）聚焦。
選擇計(jì)數(shù)室中的5 個(gè)中格（通常選四角和中央的中格，共 5 個(gè)），逐個(gè)數(shù)出每個(gè)中格內(nèi)的酵母菌細(xì)胞數(shù)。
計(jì)數(shù)規(guī)則：細(xì)胞壓線時(shí)，只計(jì)“上緣線”和“左緣線”上的細(xì)胞，“下緣線”和“右緣線”上的細(xì)胞不計(jì)（避免重復(fù)計(jì)數(shù)）；若細(xì)胞團(tuán)塊中細(xì)胞清晰可分，需按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，若團(tuán)塊緊密無(wú)法區(qū)分，可忽略或記為 1 個(gè)（需在結(jié)果中注明）。
5、結(jié)果計(jì)算：代入公式換算總濃度
血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室體積固定為0.1mm³ = 10?? mL，計(jì)算公式需根據(jù)計(jì)數(shù)板規(guī)格調(diào)整：
25×16 型計(jì)數(shù)板：
每毫升樣品中酵母菌數(shù) = 5 個(gè)中格的總細(xì)胞數(shù) × 5（換算成 25 個(gè)中格的總細(xì)胞數(shù)） × 10?（換算成 1mL 體積） × 稀釋倍數(shù)
16×25 型計(jì)數(shù)板：
每毫升樣品中酵母菌數(shù) = 4 個(gè)中格的總細(xì)胞數(shù) × 4（換算成 16 個(gè)中格的總細(xì)胞數(shù)） × 10?（換算成 1mL 體積） × 稀釋倍數(shù)
示例：用 25×16 型計(jì)數(shù)板，5 個(gè)中格共數(shù)出 80 個(gè)細(xì)胞，樣品稀釋了 100 倍，則：
每毫升酵母菌數(shù) = 80 × 5 × 10? × 100 = 4×10? CFU/mL
四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)：減少誤差的核心要點(diǎn)
稀釋度準(zhǔn)確性：稀釋時(shí)需充分振蕩樣品（尤其是固體樣品或細(xì)胞團(tuán)塊較多的樣品），確保細(xì)胞均勻分散，否則會(huì)導(dǎo)致局部濃度偏差。
計(jì)數(shù)室清潔：若計(jì)數(shù)板刻度上有殘留細(xì)胞或雜質(zhì)，需用蒸餾水沖洗后重新擦拭，避免干擾計(jì)數(shù)。
重復(fù)計(jì)數(shù)驗(yàn)證：為提高精度，建議對(duì)同一樣品進(jìn)行 2-3 次平行計(jì)數(shù)（每次更換新的稀釋液滴加），若兩次結(jié)果誤差超過(guò) 10%，需重新計(jì)數(shù)。
區(qū)分活菌與死菌：若需僅計(jì)數(shù)活菌，可在稀釋液中加入 0.1% 美藍(lán)溶液（染色 5 分鐘），活菌因細(xì)胞膜完整不被染色，死菌會(huì)被染成藍(lán)色，計(jì)數(shù)時(shí)只統(tǒng)計(jì)無(wú)色細(xì)胞即可。
避免細(xì)胞沉降不均：滴加樣品后靜置時(shí)間不足，細(xì)胞會(huì)懸浮在液體中，導(dǎo)致顯微鏡下觀察時(shí)細(xì)胞模糊或漂移；靜置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（超過(guò) 30 分鐘），細(xì)胞可能黏附在計(jì)數(shù)室底部，影響后續(xù)清洗。
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