蠟樣芽胞桿菌的活化、保存與鑒定操作步驟及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-05-22 09:01:12
蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）是一種革蘭氏陽性、產(chǎn)芽孢的細(xì)菌，廣泛存在于土壤、水及食物中。其活化、保存及鑒定是微生物學(xué)研究和檢測中的關(guān)鍵步驟，以下為詳細(xì)操作指南：
一、活化
活化是將保存的菌種恢復(fù)代謝活性并增殖的過程，通常從凍干菌種、甘油保存菌種或斜面保存菌種開始。
1、培養(yǎng)基選擇
營養(yǎng)瓊脂（NA）或胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）：通用培養(yǎng)基，適合蠟樣芽胞桿菌生長。
血瓊脂平板：觀察溶血特性（β-溶血）。
2、活化步驟
凍干菌種：無菌條件下加入適量液體培養(yǎng)基，復(fù)溶后涂布或劃線接種至固體培養(yǎng)基。
甘油菌種：用接種環(huán)蘸取少量菌液，劃線接種至平板，37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。
斜面菌種：挑取菌苔劃線接種至新鮮培養(yǎng)基。
3、培養(yǎng)條件
溫度：30-37℃（常規(guī)選擇37℃）。
時(shí)間：18-24小時(shí)，觀察乳白色、不透明、邊緣不規(guī)則的菌落（可能伴隨溶血環(huán)）。
二、保存
長期保存需避免菌種退化或污染，常用方法如下：
1、短期保存
斜面保存：接種至營養(yǎng)瓊脂斜面，4℃保存，1-2個(gè)月傳代一次。
半固體穿刺保存：穿刺接種至含0.5%瓊脂的半固體培養(yǎng)基，4℃保存，可維持3-6個(gè)月。
2、長期保存
甘油冷凍保存：
將新鮮菌液與滅菌甘油混合（終濃度15-30%），分裝至凍存管，-80℃保存（可存活數(shù)年）。
注意：甘油需高壓滅菌（121℃, 20分鐘），避免污染。
凍干保存：需專用凍干機(jī)，菌種與保護(hù)劑（如脫脂牛奶）混合后冷凍干燥，-80℃或液氮保存。
三、鑒定
1、形態(tài)學(xué)鑒定
菌落特征：乳白色、邊緣不規(guī)則、表面粗糙，部分菌株在血瓊脂上呈現(xiàn)β-溶血。
顯微形態(tài)：革蘭氏陽性大桿菌（1-1.2 × 3-5 μm），芽孢呈橢圓形、位于菌體中央或近端（需芽孢染色確認(rèn)）。
2、生化試驗(yàn)
溶血試驗(yàn)：血瓊脂上β-溶血（多數(shù)菌株）。
動(dòng)力試驗(yàn)：陽性（鞭毛運(yùn)動(dòng)，半固體穿刺呈擴(kuò)散生長）。
其他關(guān)鍵試驗(yàn)：
硝酸鹽還原：陽性
VP試驗(yàn)（Voges-Proskauer）：陽性
葡萄糖發(fā)酵：產(chǎn)酸不產(chǎn)氣
卵磷脂酶試驗(yàn)：陽性（在含卵黃的培養(yǎng)基上形成乳白色沉淀環(huán)）。
3、分子生物學(xué)鑒定
16S rRNA基因測序：通用方法，但可能無法區(qū)分近緣種。
特異性基因檢測：
gyrB（DNA旋轉(zhuǎn)酶B亞基基因）
rpoB（RNA聚合酶β亞基基因）
ces基因（嘔吐毒素基因，區(qū)分產(chǎn)毒株）。
PCR鑒定：針對蠟樣芽胞桿菌特異基因。
4、商業(yè)鑒定系統(tǒng)
API 50CH（碳水化合物利用譜）或VITEK 2系統(tǒng)：快速鑒定，需結(jié)合數(shù)據(jù)庫比對。
四、注意事項(xiàng)
生物安全：
蠟樣芽胞桿菌為條件致病菌，操作需在生物安全柜中進(jìn)行，避免氣溶膠產(chǎn)生。
芽孢處理：芽孢耐高溫，滅菌需121℃高壓20分鐘以上。
交叉污染：嚴(yán)格區(qū)分實(shí)驗(yàn)區(qū)域，避免與炭疽芽胞桿菌混淆（需在高級別實(shí)驗(yàn)室操作
炭疽桿菌）。
通過上述步驟，可系統(tǒng)完成
蠟樣芽胞桿菌的活化、保存及鑒定，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。
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