組織和細胞蛋白提取及定量的常規(guī)流程與操作步驟！
小楊 / 2025-05-21 09:49:40
一、組織樣本蛋白提取
1、實驗前準備
試劑：預(yù)冷的裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸鹽緩沖液（PBS）、液氮。
儀器：勻漿器/研磨儀、低溫離心機、冰盒、渦旋儀。
樣本處理：新鮮組織迅速用液氮速凍，保存于-80℃或立即處理。
2、操作步驟
組織解凍與稱量
取50-100 mg組織，剪碎后置于預(yù)冷研缽中，加入液氮快速研磨成粉末。
裂解
加入1 mL裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，間歇渦旋混勻。
勻漿
使用超聲破碎儀或組織勻漿器進一步破碎組織（冰上操作，避免產(chǎn)熱）。
離心
4℃、12,000 ×g 離心15分鐘，取上清（含可溶性蛋白）。
分裝保存
分裝后-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
二、細胞樣本蛋白提取
1、實驗前準備
試劑：預(yù)冷裂解液（RIPA）、蛋白酶抑制劑、PBS（含EDTA）、胰酶（貼壁細胞）。
儀器：細胞刮、離心管、低溫離心機。
2、操作步驟
細胞收集
貼壁細胞：PBS洗滌后刮取或用胰酶消化（終止后離心收集）。
懸浮細胞：直接離心（1,000 ×g，5分鐘）收集。
裂解
每1×10?細胞加入100-200 μL裂解液（含抑制劑），冰上裂解30分鐘，間歇渦旋。
離心
4℃、12,000 ×g 離心15分鐘，取上清。
保存
分裝后-80℃保存。
三、蛋白定量
1、試劑與儀器
試劑：BCA試劑盒（含標準品BSA）、PBS或裂解液。
儀器：酶標儀、96孔板、微量移液器。
2、操作步驟
標準曲線制備
用BSA標準品（0.2-2 mg/mL）按梯度稀釋（如0、0.2、0.5、1、1.5、2 mg/mL）。
樣品稀釋
將待測蛋白樣品用PBS或裂解液稀釋至標準曲線范圍內(nèi)（通常稀釋5-10倍）。
反應(yīng)體系
每孔加入25 μL標準品/樣品 + 200 μL BCA工作液，37℃孵育30分鐘。
檢測吸光度
用酶標儀測定562 nm處吸光度（OD值）。
計算濃度
根據(jù)標準曲線計算樣品濃度，公式：
蛋白濃度（μg/μL）=（稀釋后濃度 × 稀釋倍數(shù)） / 1000
四、注意事項
低溫操作：全程冰上操作，避免蛋白降解。
抑制劑使用：裂解液中需添加蛋白酶/磷酸酶抑制劑（根據(jù)實驗需求）。
避免污染：使用無核酸酶/蛋白酶污染的離心管。
線性范圍：確保樣品OD值在標準曲線線性范圍內(nèi)。
樣本保存：長期保存分裝于-80℃，短期（1周）可存于-20℃。
五、常見問題
低濃度：增加樣本量或減少裂解液體積。
高背景：離心后取上清避免吸入沉淀。
數(shù)據(jù)偏差：重復(fù)測定3次取平均值。
通過上述流程可獲得高純度蛋白樣本并準確測定濃度，為下游實驗奠定基礎(chǔ)。
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