甘油菌種保藏的準(zhǔn)備工作與具體操作步驟及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-04-27 09:34:18
甘油菌種保藏是一種常用的長(zhǎng)期保存微生物菌種的方法，適用于細(xì)菌、酵母等微生物，通常保存在-80℃低溫環(huán)境中。以下是具體步驟及注意事項(xiàng)：
一、準(zhǔn)備工作
1、菌種活化
將待保存的菌種接種到合適的固體或液體培養(yǎng)基中，置于適宜溫度下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（通常12-24小時(shí)），確保菌體處于高活性狀態(tài)。
2、材料與試劑
無(wú)菌甘油（終濃度建議15-30%，常用20%或30%甘油溶液）
無(wú)菌離心管、凍存管（建議1.5-2 mL規(guī)格）
無(wú)菌吸頭、移液器、離心機(jī)
無(wú)菌生理鹽水或液體培養(yǎng)基（用于稀釋菌液）
標(biāo)簽紙、記號(hào)筆
二、操作步驟
1、制備甘油溶液
配制40%-60%的無(wú)菌甘油溶液（終濃度根據(jù)需求調(diào)整，例如：若混合比例為1:1菌液與甘油，則甘油溶液需配成30%-60%）。
滅菌方法：高壓蒸汽滅菌（121℃, 15-20分鐘）或過濾除菌（0.22μm濾膜）。
注意：甘油黏稠，滅菌后需充分搖勻。
2、制備菌懸液
液體培養(yǎng)菌：離心收集菌體（如3000-5000 rpm, 10分鐘），棄上清，用無(wú)菌生理鹽水或液體培養(yǎng)基重懸菌體至適當(dāng)濃度（如OD600≈1.0）。
固體培養(yǎng)菌：刮取適量菌落，用無(wú)菌生理鹽水或液體培養(yǎng)基制成均勻菌懸液（可用濁法調(diào)整濃度至約10^8 CFU/mL）。
3、混合菌液與甘油
將菌懸液與滅菌甘油按比例混合（如1:1混合，終濃度甘油為15%-30%）。
充分混勻，避免氣泡產(chǎn)生。
4、分裝與標(biāo)記
將混合液分裝至無(wú)菌凍存管中，每管0.5-1 mL（避免裝滿，防止凍存時(shí)體積膨脹）。
用記號(hào)筆清晰標(biāo)注菌株名稱、保存日期、甘油濃度等信息。
5、冷凍保存
直接冷凍法：將凍存管直接放入-80℃冰箱保存（適用于大多數(shù)微生物）。
梯度降溫法（可選）：若菌種對(duì)低溫敏感，可先在4℃放置30分鐘，再轉(zhuǎn)入-20℃ 1-2小時(shí)，最后轉(zhuǎn)移至-80℃。
三、復(fù)蘇菌種
從-80℃取出凍存管，迅速置于37℃水浴中輕搖至融化（約1-2分鐘）。
用無(wú)菌吸頭吸取適量菌液，接種至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
觀察菌種活性，驗(yàn)證保存效果（如菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度等）。
四、注意事項(xiàng)
1、無(wú)菌操作：全程在超凈臺(tái)或酒精燈旁操作，避免污染。
2、甘油濃度：
濃度過高（＞30%）可能抑制菌體活性，濃度過低（＜15%）無(wú)法有效防凍。
不同菌種對(duì)甘油耐受性不同，需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。
3、菌體狀態(tài)：確保菌種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力最佳。
4、避免反復(fù)凍融：分裝時(shí)建議小體積保存，每管僅解凍一次。
5、長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)：定期檢查保存菌種的存活率（如每1-2年復(fù)蘇一次）。
五、適用性
1、適用菌種：細(xì)菌、酵母等（部分霉菌或嚴(yán)格厭氧菌需優(yōu)化方法）。
2、保存時(shí)間：-80℃下通常可保存1-5年，具體因菌種而異。
通過以上步驟，可高效保存菌種，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定可靠的菌源。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有對(duì)菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務(wù)，對(duì)購(gòu)買項(xiàng)目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項(xiàng)目準(zhǔn)確到位，都有相關(guān)人士進(jìn)行維護(hù),確保您在
微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務(wù)！也正因?yàn)榇耍本┌贇W博偉生物技術(shù)有限公司與國(guó)內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長(zhǎng)期和穩(wěn)定的合作關(guān)系！
下載附件
上一篇：厭氧性細(xì)菌鑒別技術(shù)的形態(tài)學(xué)與生化反應(yīng)及傳統(tǒng)培養(yǎng)！
下一篇：微生物增菌與分離培養(yǎng)基的使用方法及常見問題與解決方案！