單細(xì)胞懸液制備方法知多少？常見問題與注意事項(xiàng)有哪些？
小楊 / 2025-04-18 09:10:06
百歐博偉生物：?jiǎn)渭?xì)胞懸液的制備是細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、基因組學(xué)（如單細(xì)胞測(cè)序）等領(lǐng)域的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟，其核心是獲得高活性、低聚集、無碎片的單細(xì)胞分散液。以下是詳細(xì)的制備方法及注意事項(xiàng)：
一、制備流程
1、樣本類型及預(yù)處理
（1）組織樣本（如腫瘤、肝臟、脾臟等）：
快速取材：新鮮組織離體后立即置于預(yù)冷的PBS或細(xì)胞保存液中，減少細(xì)胞死亡。
去除雜質(zhì)：剔除脂肪、血管、壞死組織，避免干擾解離。
機(jī)械剪碎：用無菌剪刀或刀片將組織切成1-3 mm³小塊，增大酶接觸面積。
（2）培養(yǎng)細(xì)胞（貼壁或懸?。?/div>
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貼壁細(xì)胞：棄培養(yǎng)基→PBS輕柔洗滌→胰酶消化（含EDTA）→終止消化（含血清培養(yǎng)基）。
懸浮細(xì)胞：直接離心收集，避免過度離心（推薦200-300×g，5分鐘）。
（3）血液或骨髓：
紅細(xì)胞裂解：使用ACK裂解液（155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA）處理5-10分鐘，離心去除紅細(xì)胞碎片。
白細(xì)胞分離：Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。
2、細(xì)胞解離方法
根據(jù)樣本特性選擇機(jī)械法、酶消化法或聯(lián)合法：
（1）機(jī)械法：
研磨法：組織塊置于篩網(wǎng)（70-100 μm）上，用注射器活塞輕壓研磨，PBS沖洗收集。
吹打法：用移液器反復(fù)吹打（避免氣泡），適用較松散組織。
儀器輔助：組織解離儀程序化控制剪切力，提高一致性。
（2）酶消化法：
常用酶：
膠原酶（Collagenase I/IV）：分解膠原蛋白，適用于纖維化組織。
胰蛋白酶（Trypsin）：解離細(xì)胞間連接，需嚴(yán)格控制時(shí)間（通常5-15分鐘）。
中性蛋白酶（Dispase II）：溫和解離上皮細(xì)胞。
混合酶（如Liberase™）：商業(yè)試劑優(yōu)化酶組合，減少細(xì)胞損傷。
優(yōu)化條件：37℃水浴震蕩（5% CO2環(huán)境可增強(qiáng)效果），每10分鐘觀察解離程度。
（3）特殊處理：
DNA酶I（10-50 U/mL）：消化釋放的DNA，減少細(xì)胞粘連。
鈣螯合劑（EDTA/EGTA）：破壞鈣依賴性細(xì)胞連接，常與胰酶聯(lián)用。
3、細(xì)胞純化與過濾
離心洗滌：200-300×g離心5分鐘，重復(fù)2-3次去除酶和碎片。
梯度離心：Percoll或Ficoll分離特定密度細(xì)胞（如去除死細(xì)胞）。
過濾：依次通過100 μm、70 μm、40 μm細(xì)胞篩，去除團(tuán)塊（過濾前用PBS潤濕篩網(wǎng)減少細(xì)胞損失）。
4、細(xì)胞重懸與計(jì)數(shù)
緩沖液選擇：根據(jù)下游應(yīng)用選擇：
PBS：通用型，但缺乏營養(yǎng)，不宜久存。
培養(yǎng)基（如RPMI 1640）：含營養(yǎng)物質(zhì)，適合短期保存。
專用緩沖液（如1×PBS + 0.04% BSA）：減少細(xì)胞吸附。
活性檢測(cè)：臺(tái)盼藍(lán)染色（活細(xì)胞拒染），活率需＞85%（單細(xì)胞測(cè)序要求＞90%）。
濃度調(diào)整：稀釋至目標(biāo)濃度（如流式：1×10?/mL；10x Genomics：700-1200細(xì)胞/μL）。
二、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
1、溫度與時(shí)間控制：
酶解過程需嚴(yán)格計(jì)時(shí)，避免過度消化導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷。
全程低溫操作（冰上處理）可降低酶活，減少細(xì)胞死亡。
2、避免細(xì)胞結(jié)團(tuán)：
使用不含Ca²?/Mg²?的緩沖液。
添加0.02% DNA酶I處理粘性DNA。
輕柔吹打時(shí)沿管壁緩慢操作，避免剪切力損傷。
3、特殊樣本處理：
腫瘤組織：可能含大量壞死區(qū)，需優(yōu)先剔除；部分癌組織需延長(zhǎng)酶解至1-2小時(shí)。
神經(jīng)元/原代細(xì)胞：對(duì)機(jī)械力敏感，建議低濃度酶（如0.25%胰酶）+短時(shí)消化。
植物細(xì)胞：需額外用纖維素酶和果膠酶處理細(xì)胞壁。
4、污染防控：
操作全程無菌（超凈臺(tái)、抗生素添加）。
紅細(xì)胞裂解后需充分洗滌，避免殘留裂解液抑制后續(xù)反應(yīng)。
三、常見問題與解決方案
四、質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)
形態(tài)觀察：顯微鏡下細(xì)胞呈圓形，邊緣清晰，無大量碎片。
活率檢測(cè)：臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞占比＞85%。
聚集度檢測(cè)：流式細(xì)胞儀前向散射（FSC）與側(cè)向散射（SSC）圖呈單細(xì)胞分布，無顯著聚團(tuán)信號(hào)。
功能性驗(yàn)證：下游實(shí)驗(yàn)（如流式分選、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組）成功率達(dá)標(biāo)。
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