流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作與實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-04-18 09:44:45
流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry）是一種通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面或內(nèi)部標(biāo)記物來(lái)分析細(xì)胞特性的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域。以下是流式細(xì)胞術(shù)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)步驟：
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1、儀器準(zhǔn)備
打開(kāi)流式細(xì)胞儀，預(yù)熱激光器，運(yùn)行校準(zhǔn)微球進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。
檢查鞘液和廢液桶，確保液量充足。
2、試劑準(zhǔn)備
PBS緩沖液（含1% BSA或FBS，用于封閉非特異性結(jié)合）。
熒光標(biāo)記抗體（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇單標(biāo)或多色組合）。
細(xì)胞固定/破膜試劑（如進(jìn)行胞內(nèi)染色）。
可選：細(xì)胞活性染料（區(qū)分死細(xì)胞）。
3、樣本制備
細(xì)胞懸液：貼壁細(xì)胞用胰酶消化后重懸，懸浮細(xì)胞直接收集。
血液樣本：用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞。
組織樣本：機(jī)械或酶解（如膠原酶）消化成單細(xì)胞懸液。
用40 μm濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，去除細(xì)胞團(tuán)塊，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?~1×10?/mL。
二、抗體標(biāo)記（表面染色）
1、封閉（可選）
加入含1% BSA或同源血清的PBS，室溫避光孵育10分鐘，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。
2、抗體孵育
將細(xì)胞懸液分裝至流式管，每管加入適量熒光抗體（參考說(shuō)明書(shū)，通常1~5 μg/10?細(xì)胞）。
避光，4℃孵育30分鐘（或室溫15分鐘）。
3、洗滌
加入2 mL PBS，300×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)2次。
三、胞內(nèi)染色（可選步驟）
1、固定
加入4%多聚甲醛（PFA）或預(yù)冷的70%乙醇，室溫避光固定15~20分鐘。
2、破膜
用破膜緩沖液（含0.1% Triton X-100或商品化破膜劑）處理細(xì)胞10~15分鐘。
3、胞內(nèi)抗體孵育
加入針對(duì)胞內(nèi)抗原的抗體（如細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子），避光孵育30~60分鐘，洗滌2次。
四、上機(jī)檢測(cè)
1、樣本重懸
用300~500 μL PBS重懸細(xì)胞，立即上機(jī)檢測(cè)（或4℃避光保存，24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)）。
2、儀器設(shè)置
設(shè)置閾值（FSC/SSC排除碎片），調(diào)節(jié)電壓使細(xì)胞群位于合適區(qū)域。
使用單陽(yáng)對(duì)照調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償（補(bǔ)償矩陣）。
3、數(shù)據(jù)采集
每個(gè)樣本至少采集1×10?個(gè)細(xì)胞，保存為FCS格式文件。
五、數(shù)據(jù)分析
1、圈門(mén)策略
Step 1: FSC-A vs SSC-A，圈出目標(biāo)細(xì)胞群（排除碎片和死細(xì)胞）。
Step 2: 排除細(xì)胞團(tuán)塊（FSC-H vs FSC-A）。
Step 3: 根據(jù)熒光通道分析目標(biāo)標(biāo)記物表達(dá)。
2、軟件分析
使用FlowJo、BD FACSDiva、Kaluza等軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞比例、平均熒光強(qiáng)度（MFI）。
六、注意事項(xiàng)
1、細(xì)胞活性：盡量保持細(xì)胞活性＞90%（死細(xì)胞易非特異性結(jié)合）。
2、抗體用量：需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化抗體濃度，避免過(guò)量導(dǎo)致背景高。
3、同型對(duì)照：使用同型IgG作為陰性對(duì)照，排除非特異性信號(hào)。
4、多色實(shí)驗(yàn)：注意熒光染料的光譜重疊，合理設(shè)計(jì)panel。
以上步驟可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整，如細(xì)胞周期、凋亡檢測(cè)需額外處理。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有對(duì)菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務(wù)，對(duì)購(gòu)買(mǎi)項(xiàng)目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項(xiàng)目準(zhǔn)確到位，都有相關(guān)人士進(jìn)行維護(hù),確保您在
微生物菌種查詢(xún)網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務(wù)！也正因?yàn)榇耍本┌贇W博偉生物技術(shù)有限公司與國(guó)內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長(zhǎng)期和穩(wěn)定的合作關(guān)系！
下載附件
上一篇：?jiǎn)渭?xì)胞懸液制備方法知多少？常見(jiàn)問(wèn)題與注意事項(xiàng)有哪些？
下一篇：細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)液顏色變化的常見(jiàn)原因與解決方案及應(yīng)對(duì)措施！