乳酸桿菌 (Lactoba ill r i n c k)屬于硬壁菌門( Firmicutes) 桿菌綱 (Bacilli) 乳酸桿菌目(Lactobacillales) 乳酸桿菌科 (Lactobacillaceae)， 能發(fā)酵葡萄糖(或利用碳水化合物) 產(chǎn)生大量乳酸，廣泛分布于環(huán)境，特別是動(dòng)物的消化道、尿道，蔬菜和食品中，具有調(diào)節(jié)腸道菌群 、 預(yù)防或緩解胃腸道疾患、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、減少心血管病發(fā)病率、降低與酒精中毒性肝
病相關(guān) 的內(nèi)毒素作用等有益于人體健康的諸多生理功能。 近年來廣泛應(yīng)用于保健品、藥物、 果汁、糖果、冰淇淋的研發(fā)，某些乳酸桿菌尚被用于疾病的輔助治療。2005年初，乳酸桿
菌共有100個(gè)種，而到了2007年則多達(dá)12個(gè)種。鑒于乳酸桿菌種類的多樣性，來源的多渠道，可用于生產(chǎn)食品類別和形式的廣泛性，食用人群的敏感性等，使乳酸桿菌的安全狀況越來越受到公眾的關(guān)注。值得指出的是，乳酸桿菌的作用具有證種內(nèi)所有菌株均安全，因此正確對(duì)乳酸桿菌分離鑒定是保證其產(chǎn)品食用安全性的重要基礎(chǔ)，本文就乳酸桿菌分離鑒定的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。
1 乳酸桿菌的分離
從不同的基質(zhì)中分離乳酸桿菌時(shí)，根據(jù)乳酸桿菌所在生境的不同以及是否為優(yōu)勢菌可選擇 不同組分的培養(yǎng)基。目前比較常用的培養(yǎng)基有MRS培養(yǎng)基、 RS MA培養(yǎng)基、番茄汁瓊脂培養(yǎng)基等。
1．1 MRS培養(yǎng)基
當(dāng)乳酸桿菌是待分離區(qū)系的優(yōu)勢菌時(shí)，常用MRS培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行分離。一些常見的食品污染菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等在MRS培養(yǎng)基上生長較差或幾乎不生長，從而減少了雜菌的污染，降低了分離難度。目前MRS培養(yǎng)基已經(jīng)成為國標(biāo)上公認(rèn)的用于乳酸桿菌分離較好的培養(yǎng)基。常用于從乳酸桿菌發(fā)酵制品中分離菌種以及菌種分離后的傳代培養(yǎng)。
1.2.RSMA培養(yǎng)基
RSMA培養(yǎng)基是近幾年發(fā)展起來用于乳酸桿菌分離的一種非選擇性培養(yǎng)基，由于該培養(yǎng)基中加入0.05％的釘紅染料，因此其最大優(yōu)點(diǎn)是可以使不同菌種在其表面生長并形成顏色各異 易于鑒別的菌落。通常情況下，乳酸桿菌在RS MA培養(yǎng)基上形成 黃色菌落，而嗜熱鏈球菌為紫紅色菌落，腸球菌是白色菌落。因此，簡單培養(yǎng)后不用通過常規(guī)染色和鏡檢就可以將乳酸桿菌與其他細(xì)菌鑒別開來。ELLI等應(yīng)用RSMA培養(yǎng)基成功的從人糞便樣品中分離出了乳酸桿菌。由于此培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分比較單一，所以不適于從菌群組成復(fù)雜的環(huán)境中分離乳酸桿菌。
1.3 番茄汁瓊脂培養(yǎng)基
這是一種傳統(tǒng)的用于分離乳酸桿菌的培養(yǎng)基，此種培養(yǎng)基由于含有一定量的番茄汁，為乳酸桿菌的生長提供必要的營養(yǎng)，使得乳酸桿菌在此環(huán)境下更容易生長。但由于配置過程中需要制備新鮮番茄汁，所以操作起來較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，目前已逐漸被 MRS等培養(yǎng)基所代替。
1.4 其他培養(yǎng)基
某些選擇性培養(yǎng)基可用于從菌群復(fù)雜的基質(zhì) (例如腸道) 內(nèi)進(jìn)行乳酸桿菌的分離。APT( All Purpose Tween) 培養(yǎng)基通常用于從肉制品中分離乳酸桿菌，改良的Rogosa SL( Rogosa Sodium Lactate Modified ) 完全選擇性培養(yǎng)基則常用于胃腸內(nèi)容物中乳酸桿 菌的分離。Briggs瓊脂培養(yǎng)基和s L( Sodium Lactate) 培養(yǎng)基常用于酸奶中乳酸桿菌分離。
2 乳酸桿菌的鑒定
2.1 屬水平的鑒定
乳酸桿菌屬水平的鑒定是乳酸桿菌整體鑒定過程中較為簡單且最為基本的步驟。常用的方法是對(duì)分純后的乳酸桿菌培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，選擇無分叉的G桿菌。如果這些無分叉G桿菌經(jīng)過培養(yǎng)后，在p H 4.5的條件下能夠生長并且過氧化氫試驗(yàn)、硝酸鹽還原驗(yàn)、 聯(lián)苯胺反應(yīng)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)均為陰性即可鑒定其為乳酸桿菌屬。
2.2 種水平的鑒定
2.2.1 生化鑒定 乳酸桿菌種水平的生化試驗(yàn)主要采用糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)。不同乳酸桿菌對(duì)糖的利用情況不一，以此可作為種水平鑒定的依據(jù)。傳統(tǒng)的生化鑒定方法是配制各種特異性生化反應(yīng)管，該方法雖然成本較低。但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于大批量樣品的快速鑒定，并且反應(yīng)管種類較少所以結(jié)果的判定受限制。近年來， 法國梅里埃公司研發(fā)的API S OCH／CHL鑒定 系統(tǒng)試驗(yàn)卡是由4 9種可發(fā)酵碳水化合物組成的簡易培養(yǎng)基， 接種菌后反應(yīng)48h即可直讀 結(jié)果。由于乳酸桿菌發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)酸導(dǎo)致p H值下降使指示劑變色，所以結(jié)果極易判別。AP I 50CH／ CHL鑒定系統(tǒng)是目前國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的快速生化鑒定系統(tǒng)。缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，不適于大規(guī)模菌種的鑒定。
2.2.2 基因鑒定
2.2.2.1 P C R．隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (PCR．randomly amplified polymorphic DN A，PCR．RAPD) RAP技術(shù)是在2O世紀(jì)8 O年代末90年代初發(fā)展起來的一種新的、 能夠全面系統(tǒng)地探索基因組功能的強(qiáng)有力高新技術(shù)工具，通過對(duì)PCR產(chǎn)物的分析檢測， 以獲得基因組DN在待測區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性進(jìn)行鑒別，目前RAPD．PCR技術(shù)已成為乳酸桿菌鑒定技術(shù)的發(fā)展趨勢。2006年RANTSIO等利用RAPD技術(shù)對(duì)從發(fā)酵肉制品中分離出的三種乳酸桿菌進(jìn)行了分類，成功的將 69株彎曲乳酸桿菌歸為7類， 69株植物乳酸桿菌歸為lO類， 173株清酒乳酸桿菌歸為23類。有報(bào)道指出，若將 RAPD技術(shù)與生化反應(yīng)結(jié)果相結(jié)合可更準(zhǔn)確地鑒定乳酸桿菌。R APD具有快速、簡便、成本相對(duì)較低、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，尤其對(duì)于鑒別親緣關(guān)系較近的細(xì)菌更為有效，缺點(diǎn)是需要相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株做參比。
2.2.2.2 限制性片段長度多態(tài)性PCR( PCR ． restriction f ragment length polymorphism， PCR - Rna) RFL是一種全基因組方法，它作為第一代分子生物學(xué)方法在過去的幾年被廣泛應(yīng)用于微生物的鑒定，目前，也被廣泛應(yīng)用于乳酸桿菌的分類及鑒定。 已發(fā)表文獻(xiàn)中包括針對(duì)乳酸桿菌內(nèi)特定基因進(jìn)行特異擴(kuò)增的PC方法， 如針對(duì)t u f(encoding for elongation factor Tu) 基因PC方法可以將包括德氏乳酸桿菌德氏亞種、德氏乳酸桿菌保加利亞亞種、德氏乳 酸桿菌嗜酸亞種、嗜酸乳酸桿菌、約氏乳酸桿菌、 瑞士乳酸桿菌、 發(fā)酵乳酸桿菌等15種乳酸桿菌進(jìn)行鑒別]。針對(duì)mal( malolactic enzyme ) 基因的PCR法可以將包括唾液乳酸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、植物乳酸桿菌、 乳酸乳酸桿菌、 短乳酸桿菌等9種乳酸桿菌鑒別開來。前不久BLAIOTTA等針對(duì)乳酸桿菌的hsp6 0(heat-shock protein)基因進(jìn)行特異性PCR．RF LP擴(kuò)增，結(jié)果對(duì)包括干酪乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、 植物乳酸桿菌、 鼠李糖乳酸桿菌、 彎曲乳酸桿菌、 瑞士乳酸桿菌、發(fā)酵乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌等43種乳酸桿菌進(jìn)行明確的鑒定。RFLP的主要優(yōu)點(diǎn)在于操作簡便、快速，終點(diǎn)判斷準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是酶的選擇困難。通常情況下， 這種方法需要兩種或兩種以上的酶相結(jié)合方可對(duì)諸多菌種進(jìn)行鑒別，所以在酶的選擇上需要較高的專業(yè)知識(shí)水平，并且部分酶價(jià)格昂貴，因此實(shí)驗(yàn)成本較高。
2.2.2.3 PCR一變性梯度凝膠電泳 (PCR．denaturing g radient gelelectmphoresis。PCR．DGGE)PCR．DGG最初被用來監(jiān)測基因突變。 后來被廣泛的應(yīng)用于微生物研究，目前國外已將該技術(shù)已廣泛用于食品中乳酸桿菌菌株的篩選、分組、鑒定以及對(duì)食品品質(zhì)評(píng)估 和質(zhì)量控制。TABASCO等2007年用PCR．DGGE技術(shù)成功的將發(fā)酵奶制品中的保加利亞乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、類干酪乳酸桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌等進(jìn)行了鑒別， FONTAN等也用同樣的技術(shù)將真空包裝牛肉中的清酒乳酸桿菌、彎曲乳酸桿菌、 冷明串珠菌區(qū)分出來。由于PCR．DGGE可以區(qū)分含堿基成分不同而片段大小一致的DN A序列，甚至一個(gè)堿基對(duì)的不同都會(huì)引起DN A片段停留于凝膠的位置各異，所以與傳統(tǒng)乳酸桿菌的鑒定技術(shù)相 比，具有快速、全面的特點(diǎn)。同時(shí)DGGE技術(shù)也有其限制性，主要表現(xiàn)在：① 只能分離較小的片段(最長達(dá)1 0 0 0 b p) ，因此提供的信息有限，片段太長時(shí)解離率下降。②DGG在種水平上鑒定細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)有限。③依據(jù)16S r DNA的DGGE研究菌群多樣性，由于某些種類16 Sr DNA的拷貝之間的異質(zhì)性問題及異源核酸雙鏈分子的檢出可能會(huì)導(dǎo)致自然菌群 中細(xì)菌數(shù)量的過多估計(jì)。
2.2.2.4 多重PCR( multiplex PCR) 由于乳酸桿菌種類繁多，菌群組成復(fù)雜， 因此傳統(tǒng)的PCR方法難以達(dá)到多種乳酸桿菌快速同時(shí)鑒定的目的， 這一不足可以通過在單一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)位點(diǎn)的多重PCR預(yù)以彌補(bǔ)。由于多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因，具有節(jié)省時(shí)間、 降低成本、提高效率的優(yōu)點(diǎn)，所以一經(jīng)提出即得到研究者的青睞，并且發(fā)展迅速，現(xiàn)已成為乳 酸桿菌分類鑒定的一項(xiàng)成熟而重要的研究手段。已有學(xué)者利用這項(xiàng)技術(shù)同時(shí)將嗜酸乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌、德氏乳酸桿菌、 瑞士乳酸桿菌、 鼠李糖乳酸桿菌、 植物乳酸桿菌區(qū)
分開來。其它一些乳酸桿菌如短乳酸桿菌、發(fā)酵乳酸桿菌、 希氏乳酸桿菌、 食果糖乳酸桿 菌等都可以應(yīng)用多重PCR方法進(jìn)行一次性鑒別。該技術(shù)的難點(diǎn)在于引物的設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增條件的標(biāo)準(zhǔn)化等，此外，對(duì)操作者技術(shù)要求較高并且多重PCR的結(jié)果特異性較差。
2.2.2.4 多重PCR(multiplex PCR)由于乳酸桿菌種類繁多，菌群組成復(fù)雜， 因此傳統(tǒng)的P CR方法難以達(dá)到多種乳酸桿菌快速同時(shí)鑒定的目的，這一不足可以通過在單一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增 多個(gè)位點(diǎn)的多重PCR預(yù)以彌補(bǔ)。由于多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本、提高效率的優(yōu)點(diǎn)，所以一經(jīng)提出即得到研究者的青睞，并且發(fā)展迅速，現(xiàn)已成為乳 酸桿菌分類鑒定的一項(xiàng)成熟而重要的研究手段。已有學(xué)者利用這項(xiàng)技術(shù)同時(shí)將嗜酸乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌、德氏乳酸桿菌、 瑞士乳酸桿菌、 鼠李糖乳酸桿菌、 植物乳酸桿菌區(qū)
分開來。其它一些乳酸桿菌如短乳酸桿菌、發(fā)酵乳酸桿菌、希氏乳酸桿菌、食果糖乳酸桿菌等都可以應(yīng)用多重PCR方法進(jìn)行一次性鑒別。該技術(shù)的難點(diǎn)在于引物的設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增條件的標(biāo)準(zhǔn)化等，此外，對(duì)操作者技術(shù)要求較高并且多重PCR的結(jié)果特異性較差。
3 展望
由于乳酸桿菌對(duì)人體的作用存在株的差異，同一種內(nèi)不同株間其功能和特性各異，因此對(duì) 于乳酸桿菌種株水平鑒定技術(shù)的研究已成為國內(nèi)外研究的焦點(diǎn)，也是確保含有乳酸桿菌食品安全性的重要保障。目前，各種核酸技術(shù)在乳酸桿菌鑒定中的應(yīng)用都還處于探索性階段且各有優(yōu)缺點(diǎn)，PCR方法只能夠?qū)σ徊糠秩樗釛U菌進(jìn)行鑒別，PFGE分型方法中仍然存在著不能被鑒定的同源性菌株，未來的研究中發(fā)展和完善現(xiàn)有的核酸分型技術(shù)，創(chuàng)建更新更完備的分 型鑒定方法將是各國學(xué)者潛心研究的重點(diǎn)。目前，基因芯片技術(shù)發(fā)展迅速，并越來越多的應(yīng)用于微生物的分型和鑒定，在各種核酸分型鑒定技術(shù)成熟穩(wěn)定后，建立乳酸桿菌的基因芯片技術(shù)將指日可待。