中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng)對(duì)ATCC菌種乳酸桿菌的鑒定
中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng) / 2018-09-07 11:02:06
ATCC菌種名稱：乳酸桿菌
拉丁名：Lactobacillus sp.
統(tǒng)一編號(hào)：ATCC 8001
別名：[NCDO 103, NCIB 8115]
乳酸桿菌是指能使糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌，酸牛奶中有此菌。是一群生活在機(jī)體內(nèi)益于宿主健康的微生物，它維護(hù)人體健康和調(diào)節(jié)免疫功能的作用已被廣泛認(rèn)可。乳酸桿菌屬乳酸桿菌科，因發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸而命名。其存在廣泛，嗜酸性，生存最適ph為5.5～6.0,當(dāng)然，在ph3.0～4.5的環(huán)境中仍然能生存。它在無(wú)芽胞桿菌中是耐酸力最強(qiáng)的。 乳酸桿菌的鑒定大致可分為：基因鑒定，屬水平的鑒定，種水平的鑒定。
一、基因鑒定
隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (PCR．randomly amplified polymorphic DN A，PCR．RAPD) RAP技術(shù)是在2O世紀(jì)8 O年代末90年代初發(fā)展起來(lái)的一種新的、 能夠全面系統(tǒng)地探索基因組功能的強(qiáng)有力高新技術(shù)工具，通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的分析檢測(cè)， 以獲得基因組DN在待測(cè)區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性進(jìn)行鑒別，目前RAPD．PCR技術(shù)已成為乳酸桿菌鑒定技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。2006年RANTSIO等利用RAPD技術(shù)對(duì)從發(fā)酵肉制品中分離出的三種乳酸桿菌進(jìn)行了分類，成功的將 69株彎曲乳酸桿菌歸為7類， 69株植物乳酸桿菌歸為lO類， 173株清酒乳酸桿菌歸為23類。有報(bào)道指出，若將 RAPD技術(shù)與生化反應(yīng)結(jié)果相結(jié)合可更準(zhǔn)確地鑒定乳酸桿菌。R APD具有快速、簡(jiǎn)便、成本相對(duì)較低、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，尤其對(duì)于鑒別親緣關(guān)系較近的細(xì)菌更為有效，缺點(diǎn)是需要相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株做參比。
限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR( PCR ． restriction f ragment length polymorphism， PCR - Rna) RFL是一種全基因組方法，它作為第一代分子生物學(xué)方法在過(guò)去的幾年被廣泛應(yīng)用于微生物的鑒定，目前，也被廣泛應(yīng)用于乳酸桿菌的分類及鑒定。 已發(fā)表文獻(xiàn)中包括針對(duì)乳酸桿菌內(nèi)特定基因進(jìn)行特異擴(kuò)增的PC方法， 如針對(duì)t u f(encoding for elongation factor Tu) 基因PC方法可以將包括德氏乳酸桿菌德氏亞種、德氏乳酸桿菌保加利亞亞種、德氏乳 酸桿菌嗜酸亞種、嗜酸乳酸桿菌、約氏乳酸桿菌、 瑞士乳酸桿菌、 發(fā)酵乳酸桿菌等15種乳酸桿菌進(jìn)行鑒別]。針對(duì)mal( malolactic enzyme ) 基因的PCR法可以將包括唾液乳酸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、植物乳酸桿菌、 乳酸乳酸桿菌、 短乳酸桿菌等9種乳酸桿菌鑒別開(kāi)來(lái)。前不久BLAIOTTA等針對(duì)乳酸桿菌的hsp6 0(heat-shock protein)基因進(jìn)行特異性PCR．RF LP擴(kuò)增，結(jié)果對(duì)包括干酪乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、 植物乳酸桿菌、 鼠李糖乳酸桿菌、 彎曲乳酸桿菌、 瑞士乳酸桿菌、發(fā)酵乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌等43種乳酸桿菌進(jìn)行明確的鑒定。RFLP的主要優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便、快速，終點(diǎn)判斷準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是酶的選擇困難。通常情況下， 這種方法需要兩種或兩種以上的酶相結(jié)合方可對(duì)諸多菌種進(jìn)行鑒別，所以在酶的選擇上需要較高的專業(yè)知識(shí)水平，并且部分酶價(jià)格昂貴，因此實(shí)驗(yàn)成本較高。
PCR一變性梯度凝膠電泳 (PCR．denaturing g radient gelelectmphoresis。PCR．DGGE)PCR．DGG最初被用來(lái)監(jiān)測(cè)基因突變。 后來(lái)被廣泛的應(yīng)用于微生物研究，目前國(guó)外已將該技術(shù)已廣泛用于食品中乳酸桿菌菌株的篩選、分組、鑒定以及對(duì)食品品質(zhì)評(píng)估 和質(zhì)量控制。TABASCO等2007年用PCR．DGGE技術(shù)成功的將發(fā)酵奶制品中的保加利亞乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、類干酪乳酸桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌等進(jìn)行了鑒別， FONTAN等也用同樣的技術(shù)將真空包裝牛肉中的清酒乳酸桿菌、彎曲乳酸桿菌、 冷明串珠菌區(qū)分出來(lái)。由于PCR．DGGE可以區(qū)分含堿基成分不同而片段大小一致的DN A序列，甚至一個(gè)堿基對(duì)的不同都會(huì)引起DN A片段停留于凝膠的位置各異，所以與傳統(tǒng)乳酸桿菌的鑒定技術(shù)相 比，具有快速、全面的特點(diǎn)。同時(shí)DGGE技術(shù)也有其限制性，主要表現(xiàn)在：① 只能分離較小的片段(最長(zhǎng)達(dá)1 0 0 0 b p) ，因此提供的信息有限，片段太長(zhǎng)時(shí)解離率下降。②DGG在種水平上鑒定細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)有限。③依據(jù)16S r DNA的DGGE研究菌群多樣性，由于某些種類16 Sr DNA的拷貝之間的異質(zhì)性問(wèn)題及異源核酸雙鏈分子的檢出可能會(huì)導(dǎo)致自然菌群 中細(xì)菌數(shù)量的過(guò)多估計(jì)。
多重PCR( multiplex PCR) 由于乳酸桿菌種類繁多，菌群組成復(fù)雜， 因此傳統(tǒng)的PCR方法難以達(dá)到多種乳酸桿菌快速同時(shí)鑒定的目的， 這一不足可以通過(guò)在單一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)位點(diǎn)的多重PCR預(yù)以彌補(bǔ)。由于多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因，具有節(jié)省時(shí)間、 降低成本、提高效率的優(yōu)點(diǎn)，所以一經(jīng)提出即得到研究者的青睞，并且發(fā)展迅速，現(xiàn)已成為乳 酸桿菌分類鑒定的一項(xiàng)成熟而重要的研究手段。已有學(xué)者利用這項(xiàng)技術(shù)同時(shí)將嗜酸乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌、德氏乳酸桿菌、 瑞士乳酸桿菌、 鼠李糖乳酸桿菌、 植物乳酸桿菌區(qū)
分開(kāi)來(lái)。其它一些乳酸桿菌如短乳酸桿菌、發(fā)酵乳酸桿菌、 希氏乳酸桿菌、 食果糖乳酸桿 菌等都可以應(yīng)用多重PCR方法進(jìn)行一次性鑒別。該技術(shù)的難點(diǎn)在于引物的設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增條件的標(biāo)準(zhǔn)化等，此外，對(duì)操作者技術(shù)要求較高并且多重PCR的結(jié)果特異性較差。
多重PCR(multiplex PCR)由于乳酸桿菌種類繁多，菌群組成復(fù)雜， 因此傳統(tǒng)的P CR方法難以達(dá)到多種乳酸桿菌快速同時(shí)鑒定的目的，這一不足可以通過(guò)在單一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增 多個(gè)位點(diǎn)的多重PCR預(yù)以彌補(bǔ)。由于多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本、提高效率的優(yōu)點(diǎn)，所以一經(jīng)提出即得到研究者的青睞，并且發(fā)展迅速，現(xiàn)已成為乳 酸桿菌分類鑒定的一項(xiàng)成熟而重要的研究手段。已有學(xué)者利用這項(xiàng)技術(shù)同時(shí)將嗜酸乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌、德氏乳酸桿菌、 瑞士乳酸桿菌、 鼠李糖乳酸桿菌、 植物乳酸桿菌區(qū)
分開(kāi)來(lái)。其它一些乳酸桿菌如短乳酸桿菌、發(fā)酵乳酸桿菌、希氏乳酸桿菌、食果糖乳酸桿菌等都可以應(yīng)用多重PCR方法進(jìn)行一次性鑒別。該技術(shù)的難點(diǎn)在于引物的設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增條件的標(biāo)準(zhǔn)化等，此外，對(duì)操作者技術(shù)要求較高并且多重PCR的結(jié)果特異性較差。
二、屬水平的鑒定
乳酸桿菌屬水平的鑒定是乳酸桿菌整體鑒定過(guò)程中較為簡(jiǎn)單且最為基本的步驟。常用的方法是對(duì)分純后的乳酸桿菌培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，選擇無(wú)分叉的G桿菌。如果這些無(wú)分叉G桿菌經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，在p H 4.5的條件下能夠生長(zhǎng)并且過(guò)氧化氫試驗(yàn)、硝酸鹽還原驗(yàn)、 聯(lián)苯胺反應(yīng)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)均為陰性即可鑒定其為乳酸桿菌屬。
三、種水平的鑒定
生化鑒定 乳酸桿菌種水平的生化試驗(yàn)主要采用糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)。不同乳酸桿菌對(duì)糖的利用情況不一，以此可作為種水平鑒定的依據(jù)。傳統(tǒng)的生化鑒定方法是配制各種特異性生化反應(yīng)管，該方法雖然成本較低。但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于大批量樣品的快速鑒定，并且反應(yīng)管種類較少所以結(jié)果的判定受限制。近年來(lái)， 法國(guó)梅里埃公司研發(fā)的API S OCH／CHL鑒定 系統(tǒng)試驗(yàn)卡是由4 9種可發(fā)酵碳水化合物組成的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基， 接種菌后反應(yīng)48h即可直讀 結(jié)果。由于乳酸桿菌發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)酸導(dǎo)致p H值下降使指示劑變色，所以結(jié)果極易判別。AP I 50CH／ CHL鑒定系統(tǒng)是目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最廣泛、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的快速生化鑒定系統(tǒng)。缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，不適于大規(guī)模菌種的鑒定。