百歐博偉帶您了解ATCC菌種肉毒梭菌及肉毒毒素是怎樣檢驗(yàn)的？
中國(guó)微生物菌種查詢(xún)網(wǎng) / 2018-09-03 16:17:38
百歐博偉帶您了解ATCC菌種肉毒梭菌及肉毒毒素是怎樣檢驗(yàn)的？
一、設(shè)備和材料
1 冰箱：0℃-4℃。
2 恒溫培養(yǎng)箱士 30℃±1、35℃±1、36℃±1.
3 離心機(jī)：3 000r/min.
4 顯微鏡：10×?100×，
5 相差顯微鏡。
6 均質(zhì)器或滅菌乳鉢。
7 架盤(pán)藥物天平：0g?500g，精確至0.5g
8 厭氧培養(yǎng)裝罝：常溫催化除氧式或堿性焦性沒(méi)石子酸除氧式。
9 滅菌吸管：1ml(具0.01ml刻度〕、10ml(具0.1ml刻度〕。
10 滅菌平皿：直徑90mm.
11 滅菌錐形瓶500ml.
12 滅菌注射器1ml.
13 小白鼠：12g?15g。
二、培養(yǎng)基和試劑
1 庖肉培養(yǎng)基GB/T 4789.28—2003中 4.67。
2 卵黃瓊臘培養(yǎng)基GB/T 4789，28-2003中4.68。
3 明膠磷酸鹽緩沖液GB/T 4789.28—2003中3.23。
4 肉毒分型抗毒診斷血清。
5 胰酶：活力1 : 250。
6 革蘭氏染色液：GB/T 4789.28—2003 中 2.2.
三、操作步驟
1 肉毒毒素檢測(cè)
液狀檢樣可直接離心，固體或半流動(dòng)檢樣須加適量(例如等量、倍量或5倍量、10倍量）明膠磷酸鹽緩沖液，浸泡、研碎，然后離心，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。另取一部分上清液,調(diào)PH6.2，每9份加10%胰酶(活力1：250〉水溶液1份,混勻，不斷輕輕攪動(dòng)，37℃作用60min，進(jìn)行檢測(cè)。
2 肉毒毒素檢測(cè)以小白鼠腹腔注射法為標(biāo)準(zhǔn)方法。
檢出試驗(yàn)：取上述離心上清液及其胰酶激活處理液分別注射小白鼠三只，每只0.5ml，觀察4d注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h內(nèi)發(fā)病、死亡。主要癥狀為豎毛、四肢癱軟，呼吸困難，呼吸呈風(fēng)箱式,腰部凹陷，宛若蜂腰，最終死于呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以至癥狀不明顯時(shí)，則可將注射液做適當(dāng)稀釋?zhuān)刈鲈囼?yàn)。
確證試驗(yàn):不論上清液或其胰酶激活處理液,凡能致小鼠發(fā)病、死亡者，取樣分成三份進(jìn)行試驗(yàn)，—份加等量多型混合肉毒抗毒診斷血清,混勻，37℃作用30min，一份加等量明膠磷酸鹽緩沖液,混勻，煮沸10min,一份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻即可,不做其他處理。三份混合液分別注射小白鼠各兩只,每只0.5ml觀察4d若注射加診斷血淸與煮沸加熱的兩份混合液的小白鼠均獲保護(hù)存活，而唯有注射未經(jīng)其他處理的混合液的小白鼠以特有的癥狀死亡,則3 可判定檢樣中的肉毒毒素存在,必要時(shí)要進(jìn)行毒力測(cè)定及定型試驗(yàn)。
毒力測(cè)定:取已判定含有肉毒毒素的檢樣離心上清液，用明膠磷酸鹽緩沖液做成50倍、500倍及5 000倍的稀釋液，分別注射小白鼠各兩只，每只0.5ml，觀察4d根據(jù)動(dòng)物死亡情況,計(jì)算檢樣所含肉毒毒素的大體毒力（MLD/ml或MLD/g）例如：5倍、50倍及500倍稀釋致動(dòng)物全部死亡，而注射5 000倍稀釋液的動(dòng)物全部存活，則可大體判定檢樣上清液所含毒素的毒力為1 000MLD/ml?10 000 MLD/ml.
4 定型試驗(yàn):按毒力測(cè)定結(jié)果，用明膠磷酸鹽緩沖液將檢樣上清液稀釋至所含毒素的毒力大體在10MLD/ml~1 000 MLD/ml的范圍，分別與各單型肉毒抗診斷血清等量混勻，37℃作用30min，各注射小鼠兩只，每只0.5 ml，觀察4d同時(shí)以明膠磷酸鹽緩沖液代替診斷血清,與稀釋毒素液等量混合作為對(duì)照。能保護(hù)動(dòng)物免于發(fā)病、死亡的診斷血清型即為檢樣所含肉毒毒素的型別。
四、肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)程（見(jiàn)下圖）
肉毒梭菌屬于厭氧性梭狀芽胞桿菌屬，具有該菌的基本特性，即厭氧性的桿狀菌，形成芽胞，芽胞比繁殖體寬，呈梭狀，新鮮培養(yǎng)基的革蘭氏染色為陽(yáng)性，產(chǎn)生劇烈細(xì)菌外毒素，即肉毒毒素。 肉毒梭菌生長(zhǎng)時(shí)，可形成一種強(qiáng)力的毒素抑制呼吸導(dǎo)致死亡，這是迄今為止所知的最毒的自然生成的毒素之一。 而肉毒毒素（botulinum toxin，AX）是肉毒桿菌產(chǎn)生的含有高分子蛋白的神經(jīng)毒素，是目前已知在天然毒素和合成毒劑中毒性最強(qiáng)烈的生物毒素，它主要抑制神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿，引起肌肉松弛麻痹，特別是呼吸肌麻痹是致死的主要原因。