一 材料與方法
㈠實驗材料
⒈菌種
地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis ）由唐山師范學(xué)院微生物教研室提供
⒉培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基 ：蛋白胨1%；酵母抽提物（膏）0.5%；氯化鈉 1%；自然pH
發(fā)酵培養(yǎng)基 ：蔗糖1%；蛋白胨1%；氯化鈉 0.5%； pH7.0
⒊主要試劑
蔗糖、葡萄糖、玉米淀粉、麥芽糖、玉米漿粉、胰蛋白胨、酵母抽提物（膏）、牛肉膏、黃豆餅粉、尿素
⒋儀器設(shè)備
控溫搖床、高壓滅菌鍋、電子天平、pH-3C pH測定儀、無菌操作臺、紫外分光光度計
㈡ 方法
⒈培養(yǎng)方法
⑴ 菌種活化
將保藏的菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h備用。
⑵種子液的制備
取一環(huán)活化的菌種，接入裝量為 100 mL 種子培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，37 ℃，160 r/ min ，培養(yǎng)18 h。
⑶ 搖瓶培養(yǎng)
種子液以1%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基（裝液量100ml/250ml三角瓶）中。37℃，160 r/ min，振蕩培養(yǎng) 24 h進行單因素的發(fā)酵條件研究。
⒉發(fā)酵培養(yǎng)基單因素實驗
⑴碳源
分別用1%葡萄糖、玉米淀粉和麥芽糖等量替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的蔗糖制成培養(yǎng)基。采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，24 h后測定發(fā)酵液中的活菌含量以確定最佳碳源。
⑵ 氮源
分別用1 %酵母抽提物、牛肉膏、尿素、氯化銨替代基礎(chǔ)發(fā)酵液 1 %的胰蛋白胨。采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，24 h 后測定發(fā)酵液中的活菌含量，以確定最佳氮源。
⑶ 無機鹽
分別用 0.5 %硫酸錳、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈣及不加無機鹽的空白，替代等量的發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化鈉（0.5%）。采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，24h 后測定發(fā)酵液中的活菌總數(shù)，以確定最佳無機鹽。
㈢ 正交實驗設(shè)計
將篩選出的最優(yōu)碳源、氮源、和無機鹽3個重要因素，選用3因素3水平L9（33）正交表進行實驗，確定發(fā)酵培養(yǎng)基配比（以下簡稱優(yōu)化培養(yǎng)基），正交實驗因素及水平見表1和表2
㈣發(fā)酵條件的優(yōu)化
采用優(yōu)化培養(yǎng)基配方，對最佳發(fā)酵時間、溫度、初始pH、接種量進行逐一優(yōu)化。
㈤測定方法
活菌總數(shù)測定采用稀釋平板計數(shù)法；菌體生長曲線及發(fā)酵液生物量采用比濁法測定[9.10]；pH-3C測定儀測定菌液 pH。
二 結(jié)果與討論
?、?發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化
⑴ 碳源
分別以 1 %葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、和玉米淀粉作為碳源，其他組分均相同進行發(fā)酵，測定發(fā)酵液中的活菌總數(shù)。
葡萄糖、蔗糖和麥芽糖為碳源時地衣芽孢桿菌的生長明顯優(yōu)于玉米淀粉，利用前3種碳源發(fā)酵后，地衣芽孢桿菌活菌數(shù)超過2.2×1010CFU/ mL。而利用玉米淀粉時其活菌數(shù)在 0.9×1010CFU/ mL 以下，說明該地衣芽孢桿菌利用單糖和二糖的能力優(yōu)于淀粉。該地衣芽孢桿菌生長的最佳碳源是葡萄糖，其次是蔗糖和麥芽糖。
⑵ 氮源
以 1 %葡萄糖為碳源，分別以 1 %尿素、氯化銨、牛肉膏、酵母抽提物、胰蛋白胨為氮源制成發(fā)酵培養(yǎng)基。
有機氮源效果要明顯優(yōu)于無機氮源。利用有機氮源發(fā)酵后，地衣芽孢桿菌活菌數(shù)都超過2.20×1010CFU/mL，而利用無機氮源時的活菌數(shù)在 1.0×1010CFU/mL以下，說明該地衣芽孢桿菌利用有機氮源的能力優(yōu)于無機氮源。地衣芽孢桿菌生長的最適氮源是酵母抽提物，這與酵母抽提物富含氨基酸、小肽、核苷酸、B族維生素等生長因子有關(guān)。
⑶ 無機鹽
分別以1%葡萄糖和1%酵母抽提物為碳源和氮源，以不加無機鹽為空白，在此基礎(chǔ)上分別加入0.5%的硫酸錳、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈉及氯化鈣。
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