致瀉大腸埃希氏菌增菌與分離的關(guān)鍵步驟與操作流程！
小楊 / 2025-12-29 09:48:02
致瀉大腸埃希氏菌（Enterotoxigenic E. coli, ETEC）的增菌與分離是食品微生物學(xué)和臨床微生物學(xué)中的關(guān)鍵步驟。以下是詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案，涵蓋了從樣本處理到最終鑒定的全過(guò)程。
一、樣本處理與前增菌（Enrichment）
增菌的目的是讓目標(biāo)菌在營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境中大量繁殖，以便后續(xù)的選擇性分離。
1、選擇合適的增菌培養(yǎng)基
首選：緩沖蛋白胨水 (Buffered Peptone Water, BPW)。
作用：提供基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)，維持 pH 穩(wěn)定，為細(xì)菌生長(zhǎng)提供良好環(huán)境。
配方要點(diǎn)：蛋白胨、牛肉浸粉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀。
次選/特殊情況：
GN 增菌液 (Gram-Negative Enrichment Broth)：適用于腸道致病菌的增菌，可抑制某些革蘭氏陽(yáng)性菌。
EC 肉湯 (Escherichia coli Broth)：專(zhuān)為
大腸埃希氏菌設(shè)計(jì)的增菌培養(yǎng)基，含有乳糖、膽鹽等成分。
2、操作步驟
取樣：按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP），從待測(cè)樣品（如食品、臨床樣本）中取樣。
接種：將樣品均勻接種到 BPW 等增菌培養(yǎng)基中。接種量通常為樣品重量或體積的 10%。
培養(yǎng)：
溫度：36°C ± 1°C。
時(shí)間：18-24 小時(shí)。
氣體環(huán)境：需氧培養(yǎng)。
二、選擇性分離培養(yǎng)（Selective Isolation）
這一步的核心是使用含有抑制劑的選擇性培養(yǎng)基，抑制雜菌生長(zhǎng)，同時(shí)允許目標(biāo)菌生長(zhǎng)。
1、選擇合適的選擇性培養(yǎng)基
首選：麥康凱瓊脂 (MacConkey Agar, MAC)。
作用：
選擇性：膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)。
鑒別性：乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸，使指示劑（中性紅）變色。
觀察：
大腸埃希氏菌因發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，形成紅色或粉紅色、圓形、濕潤(rùn)、凸起的菌落。
次選/補(bǔ)充：
伊紅美藍(lán)瓊脂 (Eosin Methylene Blue Agar, EMB)：
作用：伊紅和美藍(lán)為指示劑，
大腸埃希氏菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸后，與指示劑結(jié)合形成紫黑色并有金屬光澤的菌落。
優(yōu)勢(shì)：對(duì)大腸埃希氏菌的鑒別性比 MAC 更強(qiáng)。
Hektoen Enteric Agar (HE)：適用于沙門(mén)氏菌和志賀氏菌的分離，但也能分離
大腸埃希氏菌。大腸埃希氏菌在此培養(yǎng)基上通常為黃色菌落。
2、操作步驟
接種：用無(wú)菌接種環(huán)或接種針，從增菌后的肉湯中挑取一環(huán)菌液，在 MAC 或 EMB 平板表面進(jìn)行分區(qū)劃線(xiàn)，以獲得單個(gè)菌落。
培養(yǎng)：
溫度：36°C ± 1°C。
時(shí)間：18-24 小時(shí)。
氣體環(huán)境：需氧培養(yǎng)。
三、菌落形態(tài)觀察與生化鑒定
從分離平板上挑選典型菌落進(jìn)行形態(tài)觀察和生化試驗(yàn)，以確認(rèn)其為大腸埃希氏菌。
1、典型菌落形態(tài)
MAC 平板：紅色或粉紅色，圓形，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)。
EMB 平板：紫黑色，有金屬光澤。
2、關(guān)鍵生化試驗(yàn)（API 20E 系統(tǒng)或生化管）
生化試驗(yàn) 結(jié)果 說(shuō)明
革蘭氏染色 陰性 短桿狀，無(wú)芽孢，通常成對(duì)或短鏈排列。
乳糖發(fā)酵 陽(yáng)性 產(chǎn)酸（可使指示劑變色）。
吲哚試驗(yàn) (Indole) 陽(yáng)性 產(chǎn)生吲哚。
甲基紅試驗(yàn) (Methyl Red) 陽(yáng)性 產(chǎn)生大量混合酸。
VP 試驗(yàn) (Voges-Proskauer) 陰性 不產(chǎn)生乙酰甲基甲醇。
枸櫞酸鹽利用 陰性 不能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源。
脲酶試驗(yàn) 陰性 不產(chǎn)生脲酶。
注意：
致瀉大腸埃希氏菌（ETEC）的生化特性通常與普通大腸埃希氏菌一致，主要區(qū)別在于其是否攜帶產(chǎn)生腸毒素的質(zhì)粒。因此，生化試驗(yàn)只能證明其為大腸埃希氏菌，不能直接證明其致病性。
四、血清學(xué)鑒定（可選但推薦）
血清學(xué)鑒定可以確認(rèn)菌株的血清型，對(duì)于溯源和流行病學(xué)調(diào)查非常重要。
方法：采用玻片凝集試驗(yàn) (Slide Agglutination Test)。
原理：使用針對(duì)大腸埃希氏菌 O 抗原（菌體抗原）和 H 抗原（鞭毛抗原）的特異性診斷血清。
操作：將菌落混懸于生理鹽水中，滴加相應(yīng)的診斷血清，觀察是否出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。
結(jié)果：出現(xiàn)凝集則為陽(yáng)性，表明該菌株屬于該血清型。
五、腸毒素檢測(cè)（確認(rèn)致病性）
這是區(qū)分致病性大腸埃希氏菌和非致病性菌株的關(guān)鍵步驟。
1、耐熱腸毒素 (ST)
檢測(cè)方法：乳鼠灌胃試驗(yàn)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)。
原理：ST 對(duì)熱穩(wěn)定，能引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如乳鼠）的腹瀉和嘔吐。
2、不耐熱腸毒素 (LT)
檢測(cè)方法：兔腸段結(jié)扎試驗(yàn)或細(xì)胞毒性試驗(yàn)。
原理：LT 對(duì)熱不穩(wěn)定，能引起兔腸段液體積聚或?qū)е?Vero 細(xì)胞病變。
六、總結(jié)流程
樣本 → 前增菌 (BPW, 36°C, 18-24h) → 選擇性分離 (MAC/EMB, 36°C, 18-24h) → 挑取典型菌落 → 生化鑒定 (確認(rèn)是大腸埃希氏菌) → 血清學(xué)鑒定 (確定血清型) → 腸毒素檢測(cè) (確認(rèn)致病性) → 報(bào)告結(jié)果
關(guān)鍵注意事項(xiàng)
無(wú)菌操作：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，防止樣品污染和操作者感染。
培養(yǎng)基質(zhì)量：使用質(zhì)量合格、在有效期內(nèi)的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)條件：嚴(yán)格控制培養(yǎng)溫度和時(shí)間，這對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和生化反應(yīng)結(jié)果至關(guān)重要。
安全防護(hù)：由于涉及致病菌，所有實(shí)驗(yàn)操作都應(yīng)在生物安全二級(jí)（BSL-2）或更高等級(jí)的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，并佩戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)裝備（PPE）。
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