原代培養(yǎng)的大鼠脈絡(luò)膜成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)過程中需要注意什么？
小楊 / 2025-09-02 09:50:52
原代培養(yǎng)的
大鼠脈絡(luò)膜成纖維細(xì)胞因直接來源于活體組織，細(xì)胞狀態(tài)更接近體內(nèi)生理特性，但也具有分離難度高、對外界環(huán)境敏感、易污染、增殖能力有限等特點(diǎn)，培養(yǎng)過程中需精準(zhǔn)控制各環(huán)節(jié)以保證細(xì)胞活性、純度和功能穩(wěn)定性。以下是關(guān)鍵注意事項(xiàng)，按“前期準(zhǔn)備 - 分離操作 - 培養(yǎng)維護(hù) - 質(zhì)量監(jiān)控 - 特殊風(fēng)險(xiǎn)”分類說明：
一、前期準(zhǔn)備：無菌與試劑適配是基礎(chǔ)
原代細(xì)胞對污染和試劑兼容性極敏感，前期準(zhǔn)備需杜絕所有潛在風(fēng)險(xiǎn)：
1、無菌環(huán)境控制
操作需在生物安全柜（二級及以上） 內(nèi)進(jìn)行，提前 30 分鐘開啟紫外消毒（≥20 分鐘），操作前用 75% 乙醇擦拭臺面、器械及操作者雙手 / 手套。
所有接觸細(xì)胞的耗材（培養(yǎng)皿、離心管、移液管、槍頭）需為無酶、無菌、無內(nèi)毒素規(guī)格，避免殘留化學(xué)物質(zhì)或酶類損傷細(xì)胞（如胰蛋白酶殘留會導(dǎo)致細(xì)胞貼壁困難）。
培養(yǎng)箱需定期（每周 1 次）用 75% 乙醇擦拭內(nèi)壁，或用紫外消毒（關(guān)閉培養(yǎng)箱后進(jìn)行），并監(jiān)測 CO?濃度（穩(wěn)定在 5%）和溫度（37℃±0.5℃），避免頻繁開關(guān)導(dǎo)致環(huán)境波動。
2、試劑選擇與預(yù)溫
培養(yǎng)基：需使用成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基，添加 10%-15% 胎牛血清（FBS，需篩選無支原體、低內(nèi)毒素批次，避免血清質(zhì)量差異導(dǎo)致細(xì)胞生長異常）、1% 青霉素 - 鏈霉素（雙抗，抑制細(xì)菌污染），可額外添加 5ng/mL 堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）促進(jìn)增殖。
消化液：選擇 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA（1:1），避免使用濃度過高或消化時(shí)間過長的胰酶（會破壞細(xì)胞表面蛋白）；消化前需將胰酶和培養(yǎng)基37℃預(yù)溫 10-15 分鐘，避免冷試劑刺激細(xì)胞導(dǎo)致應(yīng)激損傷。
緩沖液：使用無菌的 D-Hank’s 液或 PBS（不含 Ca²?、Mg²?，避免影響胰酶活性），用于沖洗組織和終止消化。
二、組織分離與細(xì)胞接種：減少損傷，保證純度
原代 CFs 的分離質(zhì)量直接決定后續(xù)培養(yǎng)效果，需注意以下細(xì)節(jié)：
1、組織取材與處理
選擇健康大鼠（如 SPF 級 SD 大鼠，6-8 周齡，避免老年大鼠組織纖維化嚴(yán)重導(dǎo)致細(xì)胞活性低），處死后勤快取出眼球，用 75% 乙醇快速擦拭眼球表面（≤30 秒，避免乙醇滲透損傷脈絡(luò)膜），再用無菌 D-Hank’s 液沖洗 3 次。
在解剖顯微鏡下小心剝離脈絡(luò)膜（避免混入視網(wǎng)膜、鞏膜組織，這些組織中的細(xì)胞會污染 CFs，如視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞會與 CFs 競爭生長），將脈絡(luò)膜剪成 1mm³ 以下的小塊（組織塊越小，細(xì)胞越易遷出），用 D-Hank’s 液沖洗 2-3 次去除殘留血液和雜質(zhì)。
2、消化與接種技巧
消化時(shí)將組織塊加入預(yù)溫的胰酶，37℃孵育 15-20 分鐘，期間每隔 5 分鐘輕輕震蕩 1 次，觀察組織塊邊緣是否變模糊（避免過度消化導(dǎo)致細(xì)胞裂解）；消化后立即加入 2-3 倍體積的含血清培養(yǎng)基終止胰酶活性，用吸管輕輕吹打組織塊（力度適中，避免產(chǎn)生氣泡損傷細(xì)胞），使細(xì)胞分散。
用 200 目細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液（去除未消化的組織碎片，減少雜質(zhì)污染），1000rpm 離心 5 分鐘（低速離心避免細(xì)胞破裂），棄上清后用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按1×10?-2×10?個(gè)細(xì)胞 /cm²的密度接種（密度過低易導(dǎo)致細(xì)胞貼壁困難，密度過高易出現(xiàn)接觸抑制），接種后輕輕搖晃培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻分布，放入培養(yǎng)箱靜置 24 小時(shí)（期間不移動培養(yǎng)皿，保證細(xì)胞充分貼壁）。
三、培養(yǎng)維護(hù)：精準(zhǔn)控制環(huán)境，避免污染與應(yīng)激
原代 CFs 貼壁后需精細(xì)化維護(hù)，重點(diǎn)關(guān)注“換液、傳代、污染防控”：
1、換液頻率與操作
接種后24-48 小時(shí)首次換液：此時(shí)細(xì)胞已初步貼壁，需棄去未貼壁的死細(xì)胞、殘留胰酶和組織碎片，加入新鮮培養(yǎng)基（避免舊培養(yǎng)基中積累的代謝廢物抑制細(xì)胞生長）。
后續(xù)換液：根據(jù)培養(yǎng)基顏色變化（當(dāng)培養(yǎng)基由紅色變?yōu)槌赛S色，提示 pH 下降、代謝廢物增多），每 2-3 天換液 1 次；換液時(shí)用無菌 PBS 輕輕沖洗細(xì)胞表面 1 次（避免直接沖淋細(xì)胞導(dǎo)致脫落），加入培養(yǎng)基時(shí)沿培養(yǎng)皿壁緩慢注入（避免產(chǎn)生水流沖擊細(xì)胞）。
2、傳代時(shí)機(jī)與方法
傳代時(shí)機(jī)：當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到 70%-80% 時(shí)進(jìn)行傳代（避免融合度過高導(dǎo)致接觸抑制，細(xì)胞停止增殖），原代 CFs 通常培養(yǎng) 5-7 天達(dá)到傳代標(biāo)準(zhǔn)，且傳代次數(shù)有限（一般不超過 5 代，超過后細(xì)胞易出現(xiàn)衰老、形態(tài)改變或功能喪失）。
傳代操作：棄去培養(yǎng)基，加入預(yù)溫的胰酶覆蓋細(xì)胞表面，37℃孵育 3-5 分鐘，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞收縮變圓、間隙增大時(shí)，立即加入培養(yǎng)基終止消化；用吸管輕輕吹打細(xì)胞（從培養(yǎng)皿邊緣向中心螺旋式吹打，避免遺漏角落細(xì)胞），制成單細(xì)胞懸液后按 1:2 或 1:3 的比例接種到新培養(yǎng)皿（傳代比例過高會導(dǎo)致細(xì)胞密度過低，生長緩慢）。
3、污染防控重點(diǎn)
支原體污染：支原體是原代細(xì)胞最常見的隱性污染（肉眼不可見，會抑制細(xì)胞增殖、改變細(xì)胞功能），需每 2 周用支原體檢測試劑盒檢測 1 次；若發(fā)現(xiàn)污染，需立即丟棄污染細(xì)胞（支原體難以徹底清除，避免交叉污染其他細(xì)胞），并對培養(yǎng)箱、耗材進(jìn)行徹底消毒。
細(xì)菌 / 真菌污染：若培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁（細(xì)菌污染）或白色 / 黑色斑點(diǎn)（真菌污染），需立即將污染細(xì)胞移出培養(yǎng)室，用含 2% 次氯酸鈉的溶液擦拭培養(yǎng)箱內(nèi)壁，并用無菌空氣凈化培養(yǎng)箱；日常操作中避免將瓶口長時(shí)間暴露，移液時(shí)槍頭不觸碰瓶口和臺面。
細(xì)胞交叉污染：不同細(xì)胞系（如同時(shí)培養(yǎng)視網(wǎng)膜細(xì)胞）需分開操作，使用專用的耗材和試劑，避免共用移液槍或培養(yǎng)皿導(dǎo)致交叉污染。
四、質(zhì)量監(jiān)控：確保細(xì)胞純度與功能
原代 CFs 需通過檢測確認(rèn)純度和活性，避免雜細(xì)胞影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、細(xì)胞形態(tài)觀察
每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：正常 CFs 呈長梭形或多邊形，貼壁生長，排列呈“漩渦狀”；若出現(xiàn)圓形細(xì)胞增多（細(xì)胞凋亡）、形態(tài)不規(guī)則（應(yīng)激損傷）或雜質(zhì)細(xì)胞（如上皮細(xì)胞呈多邊形、緊密排列），需分析原因（如血清質(zhì)量、污染、消化過度）并及時(shí)調(diào)整。
2、純度鑒定
采用免疫熒光染色檢測成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)志物：波形蛋白陽性（成纖維細(xì)胞標(biāo)志物），角蛋白陰性（上皮細(xì)胞標(biāo)志物）、CD31 陰性（血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物），確保 CFs 純度≥95%（雜細(xì)胞過多會干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如研究 CFs 在脈絡(luò)膜新生血管中的作用時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞污染會導(dǎo)致結(jié)果誤判）。
3、活性與功能檢測
用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性（活性≥90% 為合格）；若需用于功能實(shí)驗(yàn)（如細(xì)胞因子分泌、增殖能力檢測），需在傳代 2-3 代時(shí)進(jìn)行（此時(shí)細(xì)胞狀態(tài)最佳，衰老細(xì)胞少），避免使用傳代次數(shù)過多的細(xì)胞。
五、特殊注意事項(xiàng)
避免頻繁操作：原代 CFs 對環(huán)境變化敏感，避免頻繁觀察或移動培養(yǎng)皿（會導(dǎo)致溫度波動和細(xì)胞震動，影響貼壁和增殖）。
凍存與復(fù)蘇：若需長期保存，需在細(xì)胞融合度 70%-80% 時(shí)凍存（凍存液為培養(yǎng)基：FBS:DMSO=7:2:1，DMSO 需緩慢加入避免細(xì)胞毒性），-80℃保存≤1 個(gè)月，長期需轉(zhuǎn)入液氮；復(fù)蘇時(shí)快速 37℃水浴融化（1-2 分鐘），立即加入培養(yǎng)基稀釋 DMSO，離心后重懸接種（復(fù)蘇后細(xì)胞活性會下降，需額外添加 bFGF 促進(jìn)恢復(fù)）。
實(shí)驗(yàn)記錄：詳細(xì)記錄每一步操作（如大鼠品系、取材時(shí)間、血清批次、傳代次數(shù)、檢測結(jié)果），便于追溯實(shí)驗(yàn)差異的原因。
總之，原代
大鼠脈絡(luò)膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)核心是“無菌環(huán)境 + 溫和操作 + 精準(zhǔn)監(jiān)控”，需從試劑、操作、環(huán)境等多維度減少細(xì)胞損傷和污染，才能保證細(xì)胞的純度、活性和功能穩(wěn)定性，為后續(xù)的眼部生理（如脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)維持）或病理（如脈絡(luò)膜新生血管）研究提供可靠的細(xì)胞模型。
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