KMST-6細(xì)胞系人胚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及應(yīng)用研究！
小楊 / 2024-01-24 08:29:16
一、背景
KMST-6細(xì)胞系人胚成纖維細(xì)胞的保存條件是低溫避光，并且該細(xì)胞系的生長方式是貼壁生長，需要通過更換培養(yǎng)基來保持細(xì)胞的健康生長。這種細(xì)胞系可以通過傳代的方式來擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量，以適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)需求。
1)復(fù)蘇KMST-6細(xì)胞系人胚成纖維細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)KMST-6細(xì)胞系人胚成纖維細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)KMST-6細(xì)胞系人胚成纖維細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
用不同濃度的硫酸鈹作為受試物染毒KMST-6細(xì)胞系|人胚成纖維細(xì)胞,通過對靶細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞毒性、遺傳毒性、相關(guān)癌基因和抑癌基因蛋白表達(dá)的檢測,探討硫酸鈹對體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制。為研究鈹及其化合物致肺癌的機(jī)制提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。為鈹及其化合物所致職業(yè)危害的早期診斷和高危人群的監(jiān)護(hù)提供重要的依據(jù)。
方法：采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法觀察硫酸鈹(終濃度分別為0.2μmol/L、2.0μmol/L、20.0μmol/L、100.0μmol/L、200.0μmol/L)對KMST-6細(xì)胞系|人胚成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性;用單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)和微核試驗(yàn)測定硫酸鈹對人胚肺成纖維細(xì)胞的遺傳損傷情況。用不同濃度的硫酸鈹對人胚肺成纖維細(xì)胞重復(fù)染毒(染毒24h后,終止染毒48h,再染毒24h)后,正常培養(yǎng),分別傳至第3、6、9代,觀察靶細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化、癌基因蛋白(C-myc、H-ras蛋白)表達(dá)水平的改變和抑癌基因P16的異常甲基化。通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞生長速度的比較和轉(zhuǎn)化細(xì)胞惡性程度測試(ConA凝集試驗(yàn)),對轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)性狀鑒定。
結(jié)果：
(1)MTT比色法結(jié)果顯示:硫酸鈹重復(fù)染毒KMST-6細(xì)胞系|人胚成纖維細(xì)胞后,終濃度20.0200.0μmol/L硫酸鈹染毒組對人胚肺成纖維細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用,其OD值與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其它濃度染毒組吸光度值雖與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但對細(xì)胞增殖均有一定的抑制作用,并呈現(xiàn)一定的濃度依賴效應(yīng)(r=-0.685,P<0.01)。
(2)遺傳毒性情況:用硫酸鈹染毒KMST-6細(xì)胞系|人胚成纖維細(xì)胞后,均出現(xiàn)DNA鏈斷裂損傷,三個染毒組DNA損傷的測定指標(biāo)(尾長、尾部DNA百分含量、尾矩和Olive尾矩)與對照組間差異均有顯著性(P﹤0.05,P﹤0.01),且具有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系(rTL=0.840,r Tail DNA%=0.724,rTM=0.791,rOTM=0.851,P<0.05);出現(xiàn)微核率與對照組間差異均有顯著性(P﹤0.05,P﹤0.01),且具有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系(r=0.830,P<0.05)。
(3)相關(guān)癌基因蛋白檢測結(jié)果:不同濃度硫酸鈹染毒KMST-6細(xì)胞系|人胚成纖維細(xì)胞后,C-myc蛋白的表達(dá)在細(xì)胞分別傳至第3、6、9代時(shí),明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05,P﹤0.01),且具有劑量反應(yīng)關(guān)系(r3=0.755,r 6=0.822,r9=0.792,P<0.01);H-ras蛋白在細(xì)胞傳至第3代時(shí),雖然與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05),當(dāng)傳至第6、9代時(shí),染毒組高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05,P﹤0.01)。且具有劑量反應(yīng)關(guān)系(r3=0.163,r 6=0.586,r9=0.845,P<0.05,P<0.01)。
(4)抑癌基因P16甲基化的測定:對照組KMST-6細(xì)胞系|人胚成纖維細(xì)胞中抑癌基因P16表達(dá)非甲基化條帶,細(xì)胞傳至第3代時(shí)各染毒組細(xì)胞中也表達(dá)非甲基化條帶,細(xì)胞傳至第6、9代時(shí),除第6代低濃度染毒組表達(dá)部分甲基化條帶,其它均表達(dá)甲基化條帶。
(5)細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的硫酸鈹可不同程度誘發(fā)KMST-6細(xì)胞系|人胚成纖維細(xì)胞形成轉(zhuǎn)化灶,轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長失去接觸抑制性、飽和密度增大、ConA凝集能力增強(qiáng)等多種細(xì)胞發(fā)生惡性變的生物學(xué)表型改變。
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